Notre protocole offre une visualisation directe de la métaplasie acinaire-ductale et permet l’étude de la contribution de facteurs administrés par voie extra-utérinique ou de modulation protéique à ce processus. Le principal avantage de cette technique est que la métaplasie acinar-ductale peut être vue en temps réel et des études de signalisation cellulaire peuvent être effectuées. Pour disséquer le pancréas d’une souris euthanasiée, épinglez d’abord les pattes de la souris au couvercle en polystyrène, en l’orientant de sorte que la queue soit face au chercheur et pulvérisez l’abdomen avec 70% d’éthanol.
Utilisez des forceps autoclavés pour soulever la fourrure et la peau à la ligne médiane, et avec des ciseaux autoclavés, faire une incision à travers la fourrure et la peau de l’ouverture urétrale à la cage thoracique diaphragme. Faire des incisions supplémentaires à gauche et à droite pour couper la fourrure et la peau, créant une vue claire de la cavité abdominale. Ensuite, coupez dans la doublure péritonéale, au milieu et à droite et à gauche et tirez-la loin des organes.
Utilisez les forceps pour soulever les intestins et les déplacer vers le côté gauche de la souris, créant de l’espace pour voir le pancréas rose clair attaché à la rate ovale foncée, rouge. Le tissu pancréatique aura une texture douce et spongieuse. Découpez le pancréas, qui longe l’estomac, entrelacé avec les intestins.
Séparez la rate du pancréas et placez le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS, avec une fois la streptomiline de pénicilline et transférez-le au capot d’écoulement laminaire. Versez le contenu du tube dans un bateau de pesage vide et utilisez des forceps pour laver le pancréas en le tourbillonnant. Ensuite, utilisez les forceps pour déplacer le pancréas à un deuxième bateau de pesage contenant HBSS avec streptomycine pénicilline et laver à nouveau en tourbillonnant.
Déplacez le pancréas vers le troisième bateau de pesage contenant HBSS avec de la streptomycine de pénicilline et commencez à couper le pancréas en cinq millimètres ou en petits morceaux. Pour verser le contenu du bateau de pesage dans un tube frais de 50 millilitres, utilisez d’abord les forceps pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide pendant que le bateau est incliné. Une fois que les pièces ne sont plus fixées au bateau, versez son contenu dans le tube.
Ramasser les morceaux restants avec les forceps et laver les forceps dans le tube. Après avoir centrifugé le tube à 931 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant deux minutes, utilisez une pipette de cinq millilitres pour enlever le HBSS et toute graisse flottante. Ajouter cinq millilitres de collagène dilués dans HBSS.
Fermez le tube et assurez-vous d’un couvercle scellé en enveloppant le tube dans un film de paraffine en plastique. Placez-le dans un incubateur, en secouant à 220 rPM à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ce qui donnera la solution trouble, et peu de morceaux de tissu restants.
Pour arrêter la dissociation, placez le tube sur la glace et ajoutez cinq millilitres de HBSS froid avec 5%FBS. Après avoir centrifugé à 931 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant deux minutes, retirez le supernatant à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Suspendre à nouveau la pastille dans 10 millilitres de HBSS avec 5%FBS, et centrifugeuse à nouveau à 931 fois la gravité pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.
Retirez le supernatant à l’aide d’une pipette de cinq millilitres et répétez cette étape avec un autre 10 millilitres de HBSS avec 5%FBS. Puis suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres de HBSS avec 5%FBS. Utilisez une pipette P1000 pour filtrer la suspension cellulaire d’un millilitre à la fois à travers un maillage de 500 micromètres dans un tube de 50 millilitres.
Pour laver les cellules pancréatiques restantes à travers le maillage, ajouter cinq millilitres supplémentaires de HBSS avec 5%FBS. Ensuite, utilisez une pipette P1000 pour passer ce filtrate d’un millilitre à la fois à travers le maillage de 105 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Pipette doucement cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant HBSS avec 30%FBS, qui formera une couche de suspension cellulaire au sommet.
Centrifugeuse cette suspension cellulaire à 233 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant deux minutes et enlever le surnatant. Suspendre à nouveau la pastille contenant les cellules Acinar dans un seul milieu complet de Waymouth. Puisqu’un pancréas est suffisant pour deux infections virales, divisez la suspension cellulaire entre les couvercles de deux plaques de 35 millimètres, ce qui permet l’infection en suspension.
Pour l’infection adénoovirale, ajouter le virus à une dilution de 1/1000 au couvercle de chaque plaque et tourbillonner. Placer les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Tourbillonnez toutes les 15 minutes pendant la première heure et continuez l’incubation pendant deux heures supplémentaires.
Pour faire un gel de collagène, combinez sept millilitres de collagène de queue de rat de type un, 700 microlitres de 10 fois le milieu de Waymouth et 466,6 microlitres de 0,34 hydroxyde de sodium molaire dans un tube de 50 millilitres sur la glace pour faire du gel de collagène. Dans un tube de 50 millilitres, mélanger des volumes égaux de suspension cellulaire et de gel de collagène après trois heures d’incubation et mélanger délicatement. Plaque 2000 microlitres, un puits à la fois dans une plaque de six puits tout en gardant la plaque sur la glace et tourbillonner pour répartir uniformément la couche cellulaire de collagène.
Pour solidifier le milieu, incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 1,5 millilitres par puits d’une fois le milieu complet de Waymouth avec stimulus ou inhibiteurs désirés. Changez le milieu le lendemain, puis tous les deux jours.
Selon le stimulus utilisé, la métaplasie acinaire-ductal ou SMA peut être observée entre le troisième jour et le cinquième jour. 24 heures après l’infection par l’adénovirus GFP, des images de cellules intégrées dans la matrice de collagène ou de membrane du sous-sol, ont montré que l’infection était efficace. À cinq jours après l’infection, les cellules incorporées dans le collagène ont formé des structures de conduit-comme une fois stimulées avec 50 nanogrammes par millilitre d’alpha de TGF.
Les cellules intégrées dans la matrice membranaire du sous-sol formaient des structures en forme de conduit en l’absence d’un stimulus à cinq jours après l’infection. Alors que de plus grands conduits ont été formés lors de la stimulation avec 50 nanogrammes par millilitre de TGF alpha. Un des points les plus critiques dans le protocole est la longueur de la digestion des collagènes.
Une bonne digestion est indiquée par une solution trouble et quelques morceaux de tissu restants.
