同系小鼠原位同种异体移植物模拟胰腺癌

该协议提供了可重复的，免疫能力正常的PDAC体内模型，适用于基因型，表型和药物反应研究。该技术的主要优点是它能够在同源生物肿瘤微环境中帮助研究肿瘤进展，同时保持实验的可重复性。演示该程序的是Stefanie Barthel和Chiara Falcomata，他们都来自我们的实验室。

通过洗涤在带有磷酸盐缓冲盐水或PBS的T75培养瓶中生长的胰腺导管腺癌或PDAC细胞开始制备肿瘤细胞。然后加入0.5毫升胰蛋白酶5至10分钟，使其从烧瓶中分离。将分离的细胞重新悬浮在10毫升DMEM中，加入10%胎牛血清或FBS和0.1%青霉素链霉素，然后将细胞悬液转移到15毫升管中。

将细胞悬液在200G下离心五分钟并吸出上清液。根据注射细胞所需的最终浓度，将细胞沉淀重新悬浮在不含添加剂的DMEM中。使用Neubauer室计数10微升细胞悬液中的细胞并计算可用细胞的数量。

按照最终所需的浓度，将一毫升稀释的悬浮液转移到1.5毫升的管中。将管子放在旋转器上直到植入以防止细胞聚集。对于PDAC细胞的原位植入，在小鼠睡觉时将眼霜涂抹在镇静的小鼠身上。

在剃除镇静小鼠的左外腹之前检查足够的镇静剂。将右侧的鼠标放在无菌加热垫上，并将腿贴在表面上。戴上新手套并进行消毒。

使用手术剪刀，在脾脏突出的左胁纵向切开约1厘米的皮肤和皮下脂肪组织。使用剪刀和镊子将皮肤与腹膜分开，以便更容易进入腹膜。在用一厘米的纵向切口打开脾脏位置的腹膜之前，更换一把剪刀。

在使用钝的细镊子活动脾脏和附着的胰腺时，确保器官不附着在其他组织上。还要检查供应血管，以避免在处理胰腺时伤害血管或周围组织。小心地将胰腺从切口中拉出，以便更容易地进入器官的尾巴，并观察胰腺之后的脾脏。

确保器官在注射过程中没有折叠，并且器官的囊在针刺部位保持张力，以避免溢出。瞄准可见血管之间的一块胰腺组织，以尽量减少穿刺或注射血管的风险。使用惯用手，沿着器官的纵轴小心地用27号套管和50微升注射器穿透器官的胶囊。

将含有2， 500个细胞的20微升悬浮液注射到胰腺尾部区域后，保持胰腺和插入的注射器静止约一分钟，以避免溢出肿瘤细胞。然后，从注射部位取出针头。接下来，小心地重新排列腹部内的器官，不要伤害组织，以避免溢出细胞。

通过将一毫升0.9%氯化钠倒入器官上来避免器官粘连。使用简单的间断缝合技术缝合腹膜后，使用两到三个九毫米的不锈钢缠绕夹闭合皮肤。然后根据小鼠体重皮下注射AFN，用咪达唑仑，美地托马定和芬太尼或MMF拮抗镇静剂。

完成后，将鼠标放入 37 摄氏度的加热室中，直到它唤醒并完全活动。将活动小鼠放回其原始笼子中，并通过检查皮毛、肤色和活动来监测小鼠的健康状况，并在手术后三到四个小时重复此操作。在植入小鼠的MRI中，PDAC细胞的植入最早在手术后约7天进行腹部触诊，具体取决于注射的细胞数量以及接种细胞系的侵袭性和生长特征。

由此产生的植入小鼠的存活率取决于细胞系的肿瘤细胞内在特征。成功的胰腺内注射导致小鼠胰腺中肿瘤全面发展。相反，由于注射非活细胞、排斥植入细胞或注射细胞数量不足，植入不成功导致胰腺肿瘤的缺失。

切记注射时注意不要溢出任何细胞，也不要伤害任何周围组织，以防止细胞在腹部内扩散。按照该程序，可以在免疫活性小鼠中进行体内研究，如临床前药物反应研究，然后进行例如事实、测序或组织学分析以调查肿瘤宿主相互作用。