يقدم بروتوكولنا تصورًا مباشرًا لـ Acinar-to-Ductal Metaplasia ويسمح بدراسة مساهمة العوامل المدارة خارج الرحم أو تعديل البروتين في هذه العملية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عرض Acinar-to-Ductal Metaplasia في الوقت الحقيقي ويمكن إجراء دراسات إشارة الخلية. لتشريح البنكرياس من فأر القتل الرحيم، أولا دبوس الكفوف من الماوس إلى غطاء البوليسترين، وتوجيهه بحيث يواجه الذيل الباحث ورش البطن مع 70٪الإيثانول.
استخدام ملقط autoclaved لرفع الفراء والجلد في خط الوسط، ومع مقص autoclaved، وجعل شق من خلال الفراء والجلد من فتح مجرى البول إلى منطقة القفص الصدري الحجاب الحاجز. جعل شقوق إضافية إلى اليسار واليمين لقطع بعيدا الفراء والجلد، وخلق رؤية واضحة لتجويف البطن. ثم، وقطع في بطانة الصفاق، أسفل الوسط وإلى اليمين واليسار وسحبه بعيدا عن الأعضاء.
استخدام ملقط لرفع الأمعاء ونقلها إلى الجانب الأيسر من الماوس، وخلق مساحة لرؤية البنكرياس الوردي الفاتح تعلق على الظلام، الأحمر، والطحال البيضاوي. سوف يكون نسيج البنكرياس لينة, نسيج الإسفنجي. قطع البنكرياس، الذي يمتد على طول المعدة، متشابكة مع الأمعاء.
فصل الطحال عن البنكرياس ووضع البنكرياس في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS، مع مرة واحدة البنسلين الستربتوميسين ونقله إلى غطاء محرك تدفق اللامينا. صب محتويات الأنبوب في قارب وزن فارغ واستخدام ملقط لغسل البنكرياس عن طريق دوامة ذلك. ثم، استخدام ملقط لنقل البنكرياس إلى قارب وزن الثاني الذي يحتوي على HBSS مع ستربتوميسين البنسلين وغسل مرة أخرى عن طريق دوامة.
نقل البنكرياس إلى ثالث وزن قارب يحتوي على HBSS مع ستربتوميسين البنسلين والبدء في قطع البنكرياس إلى خمسة ملليمترات أو قطع أصغر. لصب محتويات قارب الوزن في أنبوب 50 ملليلتر جديد ، استخدم أولاً ملقط لنقل قطع البنكرياس إلى السائل حيث يتم تحويل القارب. مرة واحدة لم تعد تعلق القطع على القارب، صب محتوياته في أنبوب.
التقاط أي قطع المتبقية مع ملقط وغسل ملقط في أنبوب. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 931 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين، استخدم ماصة خمسة ملليلتر لإزالة HBSS وأية الدهون العائمة. إضافة خمسة ملليلتر من الكولاجيناز المخفف في HBSS.
أغلق الأنبوب وتأكد من وجود غطاء مغلق عن طريق تغليف الأنبوب في فيلم البارافين البلاستيكي. ضعه في حاضنة، ويرتجف عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. والتي سوف تسفر عن حل عكر، وعدد قليل من قطع الأنسجة المتبقية.
لوقف التفكك، ووضع أنبوب على الجليد وإضافة خمسة ملليلتر من HBSS الباردة مع 5٪ FBS. بعد الطرد المركزي في 931 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين، وإزالة فائقة باستخدام ماصة خمسة ملليلتر. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS، والطرد المركزي مرة أخرى في 931 مرة الجاذبية لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية.
إزالة افرنح باستخدام ماصة 5 ملليلتر وتكرار هذه الخطوة مع آخر 10 ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS. ثم إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS. استخدام ماصة P1000 لتصفية تعليق الخلية ملليلتر واحد في وقت واحد من خلال شبكة 500 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر.
لغسل أي خلايا البنكرياس المتبقية من خلال شبكة, إضافة 5 ملليلتر إضافية من HBSS مع 5٪ FBS. ثم استخدام ماصة P1000 لتمرير هذا الترشيح ملليلتر واحد في وقت واحد من خلال شبكة 105 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. بلطف هذا الماصة تعليق الخلية في أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على HBSS مع 30٪ FBS, والتي سوف تشكل طبقة من تعليق الخلية في الجزء العلوي.
الطرد المركزي هذا تعليق الخلية في 233 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين وإزالة فائقة. إعادة تعليق بيليه تحتوي على خلايا Acinar في مرة واحدة في وسط وايموث الكامل. منذ البنكرياس واحد يكفي لعدوى فيروسية اثنين، وتقسيم تعليق الخلية بين أغطية اثنين من 35 ملليمتر لوحات، والذي يسمح للعدوى في التعليق.
بالنسبة للعدوى الغدية، أضف الفيروس عند تخفيف 1/1000 إلى غطاء كل صفيحة ودوامة. ضع اللوحات في حاضنة لثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. دوامة كل 15 دقيقة للساعة الأولى ومواصلة الحضانة لمدة ساعتين إضافيتين.
لجعل هلام الكولاجين، والجمع بين سبعة ملليلتر من نوع واحد ذيل الفئران الكولاجين، 700 ميكرولتر من 10 مرات متوسطة Waymouth و 466.6 microliters من 0.34 هيدروكسيد الصوديوم المولر في أنبوب 50 ملليلتر على الجليد لجعل هلام الكولاجين. في أنبوب 50 ملليلتر، والجمع بين وحدات متساوية من تعليق الخلية وهلام الكولاجين بعد ثلاث ساعات الحضانة ومزيج بلطف. لوحة 2000 ميكرولترات، بئر واحد في وقت واحد في لوحة ستة بئر مع الحفاظ على لوحة على الجليد ودوامة لتوزيع طبقة الخلايا الكولاجين بالتساوي.
لترسيخ المتوسطة، احتضان لوحة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة 1.5 ملليلتر في بئر واحد من الوقت وسيلة وايموث كاملة مع التحفيز المطلوب أو مثبطات. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ثم كل يوم.
اعتمادا على التحفيز المستخدمة، يمكن ملاحظة Acinar-to-Ductal Metaplasia أو ADM بين اليوم الثالث واليوم الخامس. 24 ساعة بعد العدوى مع فيروس الغدة GFP، صور الخلايا جزءا لا يتجزأ من الكولاجين أو مصفوفة الغشاء الطابق السفلي، وأظهرت أن العدوى كانت فعالة. في خمسة أيام بعد العدوى، شكلت الخلايا جزءا لا يتجزأ من الكولاجين هياكل تشبه القناة عندما حفزت مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من TGF ألفا.
شكلت الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة غشاء الطابق السفلي هياكل تشبه القناة في غياب التحفيز في خمسة أيام بعد العدوى. في حين تم تشكيل قنوات أكبر على التحفيز مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من TGF ألفا. واحدة من النقاط الأكثر أهمية في البروتوكول هو طول هضم الكولاجيناز.
يشار إلى الهضم السليم من قبل محلول عكر وعدد قليل من قطع الأنسجة المتبقية.
