Il nostro protocollo offre la visualizzazione diretta della Metaplasia Acinar-to-Ductal e consente lo studio del contributo di fattori somministrati ectopicamente o modulazione proteica a questo processo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la Metaplasia da Acinar a Ductal può essere vista in tempo reale e possono essere eseguiti studi di segnalazione cellulare. Per sezionare il pancreas da un topo eutanasiato, per prima cosa inchiodare le zampe del topo al coperchio in polistirolo, orientarlo in modo che la coda sia rivolta verso il ricercatore e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo.
Utilizzare le forceza autoclavate per sollevare la pelliccia e la pelle a metà linea e, con le forbici autoclavate, fare un'incisione attraverso la pelliccia e la pelle dall'apertura uretrale all'area della gabbia toracica del diaframma. Fai ulteriori incisioni a sinistra e a destra per tagliare via la pelliccia e la pelle, creando una visione chiara della cavità addominale. Quindi, tagliare nel rivestimento peritoneale, verso il centro e a destra e a sinistra e tirarlo via dagli organi.
Usa le forcep per sollevare l'intestino e spostarli sul lato sinistro del mouse, creando spazio per vedere il pancreas rosa chiaro attaccato alla milza scura, rossa e ovale. Il tessuto pancreatico avrà una consistenza morbida e spugnosa. Ritaglia il pancreas, che corre lungo lo stomaco, intrecciandosi con l'intestino.
Separare la milza dal pancreas e posizionare il pancreas in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS, con una volta la streptomicina di penicillina e trasferirlo nella cappa di flusso laminare. Versare il contenuto del tubo in una barca di pesatura vuota e utilizzare le forcep per lavare il pancreas ruotandolo. Quindi, utilizzare le forcep per spostare il pancreas su una seconda barca di pesatura contenente HBSS con streptomicina penicillina e lavare di nuovo ruotando.
Spostare il pancreas sulla terza barca di pesata contenente HBSS con streptomicina penicillina e iniziare a tagliare il pancreas in cinque millimetri o pezzi più piccoli. Per versare il contenuto della barca di pesatura in un tubo fresco da 50 millilitri, utilizzare prima le forcep per spostare i pezzi del pancreas nel liquido mentre la barca viene ribaltata. Una volta che i pezzi non sono più attaccati alla barca, versare il suo contenuto nel tubo.
Raccogliere i pezzi rimanenti con le forcep e lavare le forcep nel tubo. Dopo aver centrifugato il tubo a 931 volte la gravità a quattro gradi Celsius per due minuti, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per rimuovere l'HBSS e qualsiasi grasso galleggiante. Aggiungere cinque millilitri di collagenasi diluiti in HBSS.
Chiudere il tubo e assicurarsi un coperchio sigillato avvolgendo il tubo in pellicola di paraffina di plastica. Mettilo in un'incubatrice, tremando a 220 giri/min a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Che produrrà la soluzione torbida e pochi pezzi di tessuto rimanenti.
Per interrompere la dissociazione, posizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere cinque millilitri di HBSS freddo con 5%FBS. Dopo aver centrifugato a 931 volte la gravità a quattro gradi Celsius per due minuti, rimuovere il supernatante usando una pipetta da cinque millilitri. Sospendere nuovamente il pellet in 10 millilitri di HBSS con 5%FBS e centrifugare nuovamente a 931 volte la gravità per due minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il supernatante utilizzando una pipetta da cinque millilitri e ripetere questo passaggio con altri 10 millilitri di HBSS con 5%FBS. Quindi sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di HBSS con 5%FBS. Utilizzare una pipetta P1000 per filtrare la sospensione cellulare di un millilitro alla volta attraverso una rete da 500 micrometri in un tubo da 50 millilitri.
Per lavare le celle pancreatiche rimanenti attraverso la rete, aggiungere altri cinque millilitri di HBSS con 5%FBS. Quindi utilizzare una pipetta P1000 per passare questo filtrato un millilitro alla volta attraverso la rete da 105 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Pipettare delicatamente questa sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri contenente HBSS con 30%FBS, che formerà uno strato di sospensione cellulare nella parte superiore.
Centrifuga questa sospensione cellulare a 233 volte la gravità a quattro gradi Celsius per due minuti e rimuovi il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet contenente le cellule Acinar in un mezzo completo di Waymouth. Poiché un pancreas è sufficiente per due infezioni virali, dividere la sospensione cellulare tra i coperchi di due piastre da 35 millimetri, il che consente l'infezione in sospensione.
Per l'infezione adenovirale, aggiungere il virus con una diluizione 1/1000 al coperchio di ogni piastra e ruotare. Posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Ruotare ogni 15 minuti per la prima ora e continuare l'incubazione per altre due ore.
Per produrre un gel di collagene, combinare sette millilitri di collagene di coda di ratto di tipo uno, 700 microlitri di 10 volte il mezzo di Waymouth e 466,6 microlitri di idrossido di sodio molare 0,34 in un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio per produrre gel di collagene. In un tubo da 50 millilitri, combinare uguali volumi di sospensione cellulare e gel di collagene dopo tre ore di incubazione e mescolare delicatamente. Piastra 2000 microlitri, un pozzo alla volta in una piastra di sei poggiasolo mantenendo la piastra sul ghiaccio e ruotando per distribuire uniformemente lo strato cellulare di collagene.
Per solidificare il mezzo, incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi aggiungere 1,5 millilitri per pozzo di uno volte il mezzo completo di Waymouth con lo stimolo o gli inibitori desiderati. Cambiare il mezzo il giorno seguente e poi a giorni diversi.
A seconda dello stimolo utilizzato, la metaplasia acinare-ductale o ADM può essere osservata tra il terzo e il quinto giorno. 24 ore dopo l'infezione da adenovirus GFP, le immagini delle cellule incorporate nella matrice di collagene o membrana basale hanno dimostrato che l'infezione era efficiente. A cinque giorni dall'infezione, le cellule incorporate in strutture simili a condotto formate da collagene quando stimolate con 50 nanogrammi per millilitro di TGF alpha.
Le cellule incorporate nella matrice della membrana basale formavano strutture simili a dutti in assenza di uno stimolo a cinque giorni dopo l'infezione. Mentre i condotti più grandi si formavano alla stimolazione con 50 nanogrammi per millilitro di TGF alfa. Uno dei punti più critici del protocollo è la lunghezza della digestione della collagenasi.
Una corretta digestione è indicata da una soluzione torbida e pochi pezzi di tessuto rimanenti.
