Наш протокол предлагает прямую визуализацию метаплазии Acinar-to-Ductal и позволяет изучать вклад эктопически вводимых факторов или белковой модуляции в этот процесс. Основным преимуществом этого метода является то, что Ацинар-к-Ductal Метаплазия может рассматриваться в режиме реального времени и клеточной сигнализации исследования могут быть выполнены. Чтобы вскрыть поджелудочную железу от усыпанной мыши, сначала прикрепите лапы мыши к крышке полистирола, ориентируя ее так, чтобы хвост столкнулся с исследователем и распылите живот 70%этанолом.
Используйте автоклавные типсы, чтобы поднять мех и кожу в средней линии, и с автоклавными ножницами, сделать разрез через мех и кожу от уретрового отверстия до области грудной клетки диафрагмы. Сделайте дополнительные разрезы влево и вправо, чтобы отрезать мех и кожу, создавая четкое представление о брюшной полости. Затем нарезать брюшной подкладкой, посередине и вправо и влево и вытащить его из органов.
Используйте типсы, чтобы поднять кишечник и переместить их в левую сторону мыши, создавая пространство, чтобы увидеть светло-розовый поджелудочной железы прилагается к темной, красной, овальной селезенки. Ткань поджелудочной железы будет иметь мягкую, губчатую текстуру. Вырежьте поджелудочную железу, которая проходит вдоль желудка, переплетаясь с кишечником.
Отделить селезенку от поджелудочной железы и поместить поджелудочной железы в 50 миллилитров трубки, содержащей 10 миллилитров HBSS, с одним разом пенициллин стрептомицин и передать его в ламинарный капюшон потока. Налейте содержимое трубки в пустую лодку взвешивания и использовать типсы для мытья поджелудочной железы, закрученного его. Затем, использовать типсы для перемещения поджелудочной железы на второй вес лодки, содержащей HBSS с пенициллин стрептомицин и мыть снова закрученного.
Перемещение поджелудочной железы на третий вес лодки, содержащей HBSS с пенициллин стрептомицин и начать резки поджелудочной железы на пять миллиметров или меньше частей. Чтобы залить содержимое лодки взвешивания в свежую 50-миллилитровую трубку, сначала используйте типсы для перемещения частей поджелудочной железы в жидкость, как лодка в настоящее время наконечником. Как только кусочки больше не прикрепляются к лодке, вылейте ее содержимое в трубку.
Возьмите все оставшиеся кусочки с типсами и мыть типсы в трубке. После центрифугирования трубки при 931 раз гравитации при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут, используйте пятими миллилитровую пипетку для удаления HBSS и любого плавающего жира. Добавьте пять миллилитров коллагеназы, разбавленной в HBSS.
Закройте трубку и убедитесь, что запечатанная крышка, обернув трубку в пластиковую парафиновую пленку. Поместите его в инкубатор, встряхивая при 220 об/мин при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Что даст мутный раствор, и несколько оставшихся частей ткани.
Чтобы остановить диссоциацию, поместите трубку на лед и добавьте пять миллилитров холодного HBSS с 5%FBS. После центрифугирования при 931 раз гравитации при четырех градусах Цельсия в течение двух минут, удалите супернатант с помощью пятими миллилитровой пипетки. Повторно приостановить гранулы в 10 миллилитров HBSS с 5%FBS, и центрифуга снова при 931 раз тяжести в течение двух минут при четырех градусах по Цельсию.
Удалите супернатант с помощью пятими миллилитров пипетки и повторите этот шаг с еще 10 миллилитров HBSS с 5%FBS. Затем повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров HBSS с 5%FBS. Используйте пипетку P1000 для фильтрации подвески клетки по миллилитру через 500-метровую сетку в 50-миллилитровую трубку.
Чтобы вымыть оставшиеся клетки поджелудочной железы через сетку, добавьте дополнительные пять миллилитров HBSS с 5%FBS. Затем используйте пипетку P1000, чтобы передать этот фильтрат по миллилитру через 105-метровую сетку в 50-миллилитровую трубку. Аккуратно пипетка этой клеточной подвески в 50 миллилитровую трубку, содержащую HBSS с 30%FBS, который сформирует слой клеточной подвески в верхней части.
Центрифуга этой клетки подвески при 233 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут и удалить супернатант. Повторно приостановить гранулы, содержащие клетки Acinar в один раз Waymouth в полной среде. Так как одной поджелудочной железы достаточно для двух вирусных инфекций, разделить клеточной подвески между крышками двух 35-миллиметровых пластин, что позволяет инфекции в подвеске.
Для аденовирусной инфекции, добавить вирус при разбавлении 1/1000 к крышке каждой пластины и вихрем. Поместите пластины в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5%CO2. Закружить каждые 15 минут в течение первого часа и продолжить инкубацию в течение дополнительных двух часов.
Чтобы сделать коллагеновый гель, объединить семь миллилитров типа один крысы хвост коллагена, 700 микролитров в 10 раз Waymouth среднего и 466,6 микролитров 0,34 молярного гидроксида натрия в 50 миллилитров трубки на льду, чтобы коллаген гель. В 50-миллилитровой трубке смешайте равные объемы клеточной суспензии и коллагенового геля после трехчасовой инкубации и аккуратно перемешайте. Плита 2000 микролитров, один хорошо в то время, в шесть пластины хорошо, сохраняя при этом пластины на льду и вихрем равномерно распределить слой коллагеновых клеток.
Чтобы затвердеть среду, инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение 30 минут. Затем добавьте 1,5 миллилитров на колодец одного раза полной среды Waymouth с желаемым стимулом или ингибиторами. Изменение среды на следующий день, а затем через день.
В зависимости от используемого стимула, Acinar-to-Ductal Metaplasia или ADM можно наблюдать между тремя днями и днем пять. 24 часа после заражения аденовирусом GFP, изображения клеток, встроенных в коллаген или мембранной матрицы подвала, показали, что инфекция была эффективной. В течение пяти дней после заражения, клетки, встроенные в коллаген формируется проток-как структуры, когда стимулировали с 50 нанограмм на миллилитр альфа TGF.
Клетки, встроенные в мембранную матрицу подвала, образуют протоковые структуры при отсутствии стимула в течение пяти дней после заражения. Тогда как более большие воздуховоды были сформированы на стимуляции с 50 nanograms в миллилитр альфа TGF. Одним из наиболее важных моментов в протоколе является длина пищеварения коллагеназы.
Правильное пищеварение указывается мутный раствор и несколько оставшихся частей ткани.
