Nuestro protocolo ofrece visualización directa de la Metaplasia Acinar-Ductal y permite el estudio de la contribución de factores administrados ectópicamente o modulación de proteínas a este proceso. La principal ventaja de esta técnica es que la Metaplasia Acinar-ductal se puede ver en tiempo real y se pueden realizar estudios de señalización celular. Para diseccionar el páncreas de un ratón eutanasiado, primero clavar las patas del ratón a la tapa de poliestireno, orientarlo de modo que la cola está frente al investigador y rociar el abdomen con 70%etanol.
Utilice fórceps autoclaves para levantar el pelaje y la piel en la línea media, y con tijeras autoclaves, haga una incisión a través del pelaje y la piel desde la abertura uretral hasta el área de la caja torácica del diafragma. Haga incisiones adicionales a la izquierda y a la derecha para cortar el pelaje y la piel, creando una vista clara de la cavidad abdominal. Luego, corta en el revestimiento peritoneal, por el centro y hacia la derecha y la izquierda y aparta de los órganos.
Usa los fórceps para levantar los intestinos y moverlos al lado izquierdo del ratón, creando espacio para ver el páncreas rosado claro unido al bazo oscuro, rojo y ovalado. El tejido pancreático tendrá una textura suave y esponjosa. Cortar el páncreas, que corre a lo largo del estómago, entrelazando con los intestinos.
Separe el bazo del páncreas y coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS, con una vez estreptomicina de penicilina y transfiéralo a la campana de flujo laminar. Vierta el contenido del tubo en un bote de pesaje vacío y use fórceps para lavar el páncreas arremolinado. Luego, utilice los fórceps para mover el páncreas a un segundo bote de pesaje que contenga HBSS con estreptomicina de penicilina y lavar de nuevo girando.
Mueva el páncreas al tercer bote de pesaje que contiene HBSS con estreptomicina de penicilina y comience a cortar el páncreas en trozos de cinco milímetros o más pequeños. Para verter el contenido del bote de pesaje en un tubo fresco de 50 mililitros, primero utilice los fórceps para mover las piezas del páncreas en el líquido mientras el barco está siendo inclinado. Una vez que las piezas ya no estén unidas al barco, vierta su contenido en el tubo.
Recoja las piezas restantes con los fórceps y lave los fórceps en el tubo. Después de centrifugar el tubo a 931 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante dos minutos, utilice una pipeta de cinco mililitros para eliminar el HBSS y cualquier grasa flotante. Añadir cinco mililitros de colagenasa diluidos en HBSS.
Cierre el tubo y asegúrese de que la tapa esté sellada envolviendo el tubo en una película de parafina de plástico. Colóquelo en una incubadora, agitando a 220 RPM a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Lo que producirá la solución turbia, y pocos trozos de tejido restantes.
Para detener la disociación, coloque el tubo sobre hielo y agregue cinco mililitros de HBSS frío con 5%FBS. Después de centrifugar a 931 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante dos minutos, retire el sobrenadante usando una pipeta de cinco mililitros. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de HBSS con 5% FBS, y centrifugar de nuevo a 931 veces la gravedad durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante con una pipeta de cinco mililitros y repita este paso con otros 10 mililitros de HBSS con 5%FBS. A continuación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de HBSS con 5%FBS. Utilice una pipeta P1000 para filtrar la suspensión celular de un mililitro a la vez a través de una malla de 500 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.
Para lavar las células pancreáticas restantes a través de la malla, agregue cinco mililitros adicionales de HBSS con 5%FBS. A continuación, utilice una pipeta P1000 para pasar este filtrado de un mililitro a la vez a través de la malla de 105 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Pipetee suavemente esta suspensión celular en un tubo de 50 mililitros que contenga HBSS con 30%FBS, que formará una capa de suspensión celular en la parte superior.
Centrifugar esta suspensión celular a 233 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante dos minutos y retire el sobrenadante. Re-suspende el pellet que contiene las células Acinar en una vez el medio completo de Waymouth. Dado que un páncreas es suficiente para dos infecciones virales, dividir la suspensión celular entre los párpados de dos placas de 35 milímetros, lo que permite la infección en suspensión.
Para la infección adenoviral, agregue el virus a una dilución de 1/1000 a la tapa de cada plato y gire. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5%CO2. Gire cada 15 minutos durante la primera hora y continúe la incubación durante dos horas adicionales.
Para hacer un gel de colágeno, combine siete mililitros de colágeno de cola de rata tipo uno, 700 microlitros de 10 veces el medio de Waymouth y 466,6 microlitros de 0,34 molar de hidróxido de sodio en un tubo de 50 mililitros sobre hielo para hacer gel de colágeno. En un tubo de 50 mililitros, combine volúmenes iguales de suspensión celular y gel de colágeno después de tres horas de incubación y mezcle suavemente. Placa 2000 microlitros, uno bien a la vez en una placa de seis pozos mientras mantiene la placa en hielo y remolino para distribuir uniformemente la capa de celda de colágeno.
Para solidificar el medio, incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, añadir 1,5 mililitros por pozo de una de las veces medio completo de Waymouth con estímulo o inhibidores deseados. Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días.
Dependiendo del estímulo utilizado, se puede observar metaplasia a-ductal o ADM entre el día tres y el día cinco. 24 horas después de la infección con adenovirus GFP, imágenes de células incrustadas en colágeno o matriz de membrana sótano, mostraron que la infección era eficiente. A los cinco días después de la infección, las células incrustadas en estructuras similares a conductos de colágeno cuando se estimulan con 50 nanogramos por mililitro de TGF alfa.
Las células incrustadas en la matriz de membrana del sótano formaron estructuras similares a conductos en ausencia de un estímulo a los cinco días después de la infección. Mientras que los conductos más grandes se formaron tras la estimulación con 50 nanogramos por mililitro de TGF alfa. Uno de los puntos más críticos en el protocolo es la longitud de la digestión de la colagenasa.
La digestión adecuada se indica mediante una solución turbia y pocos trozos de tejido restantes.
