우리의 프로토콜은 Acinar-to-덕탈 메타플라시아의 직접적인 시각화를 제공하고 이 과정에 국소 투여 된 요인 또는 단백질 변조의 기여에 대한 연구를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 아시나르-덕탈 메타플라시아가 실시간으로 볼 수 있고 세포 신호 연구가 수행될 수 있다는 것입니다. 안락사 된 마우스에서 췌장을 해부하려면 먼저 마우스의 발을 폴리스티렌 뚜껑에 고정하고 꼬리가 연구원을 향하도록 방향을 지정하고 70 %의 에탄올로 복부를 분사하십시오.
오토클레이브 포셉을 사용하여 미드라인에서 털과 피부를 들어 올리고, 자동 가위를 사용하여 요도 개구부에서 다이어프램 리브 케이지 부위에 이르기까지 모피와 피부를 절개합니다. 왼쪽과 오른쪽에 추가 절개를 하여 털과 피부를 잘라 내어 복강의 선명한 시야를 만듭니다. 그런 다음 복막 안감으로 자르고 중간과 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 장기에서 끌어냅니다.
집게를 사용하여 내장을 들어 올리고 마우스 왼쪽으로 이동하여 어두운 빨간색, 타원형 비장에 부착 된 밝은 분홍색 췌장을 볼 수있는 공간을 만듭니다. 췌장 조직은 부드럽고 스폰지 질감을 갖습니다. 위장을 따라 흐르는 췌장을 잘라 내고 창자와 얽혀 있습니다.
췌장에서 비장을 분리하고 췌장을 HBSS 10 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브에 넣고 페니실린 연쇄 절제술을 한 번 씩 사용하여 라미나르 플로우 후드로 옮겨냅니다. 튜브의 내용물을 빈 계량 보트에 붓고 집게를 사용하여 췌장을 소용돌이로 씻어냅니다. 그런 다음, 집게를 사용하여 췌장을 페니실린 연쇄상 구균증으로 HBSS가 함유 된 두 번째 계량 보트로 이동하고 소용돌이에 의해 다시 씻습니다.
췌장을 페니실린 연쇄상 구균증으로 HBSS가 함유된 세 번째 계량 보트로 옮기고 췌장을 5mm 또는 작은 조각으로 자르기 시작합니다. 계량 보트의 내용을 신선한 50 밀리리터 튜브에 붓기 위해 먼저 집게를 사용하여 배가 기울어질 때 췌장 조각을 액체로 옮겨 넣습니다. 조각이 더 이상 보트에 부착되지 않은 후, 튜브에 그 내용을 부어.
집게로 남은 조각을 집어 들고 튜브의 집게를 씻으십시오. 2 분 동안 섭씨 4도에서 931 배 중력으로 튜브를 원심 분리 한 후 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 HBSS 및 부동 지방을 제거하십시오. HBSS에 희석된 콜라게나아제 5밀리리터를 추가합니다.
튜브를 닫고 튜브를 플라스틱 파라핀 필름으로 래핑하여 밀봉 된 뚜껑을 확인하십시오. 인큐베이터에 놓고 20분 동안 섭씨 37도에서 220 RPM에서 흔들어 놓습니다. 탁탁액을 산출하고 남은 조직 조각은 거의 없습니다.
해리를 막으려면 튜브를 얼음 위에 놓고 5%의 FBS로 차가운 HBSS 5밀리리터를 추가합니다. 2분 동안 섭씨 4도에서 931배의 중력에서 원심분리한 후 5밀리리터 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다. 5%의 FBS로 HBSS 의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 2분 동안 931배의 중력으로 다시 정지합니다.
5 밀리리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거하고 5 % FBS와 HBSS의 또 다른 10 밀리리터와이 단계를 반복합니다. 그런 다음 5 %의 FBS로 HBSS의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. P1000 파이펫을 사용하여 500 마이크로미터 메쉬를 통해 한 번에 1밀리리터의 셀 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다.
메쉬를 통해 남은 췌장 세포를 세척하려면 5%의 FBS를 사용하여 HBSS의 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 P1000 파이펫을 사용하여 105 마이크로미터 메쉬를 통해 한 번에 이 여과 1 밀리리터를 50 밀리리터 튜브로 전달합니다. 이 셀 서스펜션을 30%의 FBS로 HBSS를 함유한 50밀리리터 튜브로 부드럽게 피펫하여 상단에 셀 서스펜션 층을 형성합니다.
원심 분리는 2 분 동안 섭씨 4도에서 233 배 중력으로 이 세포 현탁액을 제거하고 상퍼를 제거합니다. 웨이머스의 완전한 배지를 1회 나타내세포에 함유한 펠릿을 다시 중단한다. 한 췌장은 두 개의 바이러스 성 감염에 대 한 충분 하기 때문에, 두 개의 뚜껑 사이 세포 현탁액을 분할 35 밀리 미터 플레이트, 현 탁 트에 감염을 허용.
아데노바이러스 감염의 경우, 각 플레이트의 뚜껑에 1/1000 희석에 바이러스를 추가하고 소용돌이칩니다. 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 섭씨 37도, CO2 5%로 배치합니다. 첫 번째 시간 동안 15 분마다 소용돌이를 가하고 추가 로 2 시간 동안 인큐베이션을 계속하십시오.
콜라겐 젤을 만들기 위해 1형 쥐 꼬리 콜라겐 7밀리리터, 웨이머스 의 10배 의 마이크로리터 700개, 얼음 위에 50밀리리터 튜브에 수산화나트륨 466.6 마이크로리터를 결합하여 콜라겐 젤을 만듭니다. 50 밀리리터 튜브에서 3시간 동안 배양한 후 동일한 양의 셀 서스펜션과 콜라겐 젤을 결합하고 부드럽게 섞습니다. 플레이트 2000 마이크로리터는 접시를 얼음에 보관하고 소용돌이면서 6개의 우물 판에 한 번에 잘 하여 콜라겐 세포 층을 고르게 분배합니다.
매체를 고화시키기 위해 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분간 배양한다. 그런 다음 원하는 자극이나 억제제로 Waymouth의 전체 배지를 1배 나 잘 할 때 1.5 밀리리터를 추가합니다. 다음 날, 그리고 격일로 매체를 변경합니다.
사용되는 자극에 따라, 아시나르-덕탈 메타플라시아 또는 ADM은 3일째와 5일 사이에 관찰될 수 있다. GFP 아데노바이러스를 통한 감염 후 24시간, 콜라겐 또는 지하 막 매트릭스에 내장된 세포의 이미지는 감염이 효율적이라는 것을 보여주었다. 5 일 감염 후, 콜라겐형성 덕트 구조에 내장 된 세포는 TGF 알파의 밀리 리터 당 50 나노 그램으로 자극 할 때 덕트 같은 구조를 형성.
지하 막 매트릭스에 내장 된 세포는 감염 후 5 일 동안 자극이없는 덕트 와 같은 구조를 형성했다. 반면 더 큰 덕트는 TGF 알파의 밀리리터 당 50 나노그램으로 자극시 형성되었다. 프로토콜에서 가장 중요한 점 중 하나는 콜라게나아제 소화의 길이입니다.
적절한 소화는 탁탁액과 남은 조직 조각으로 표시됩니다.
