Nosso protocolo oferece visualização direta da Metaplasia Acinar-ductal e permite o estudo da contribuição de fatores administrados ectoticamente ou modulação proteica para este processo. A principal vantagem dessa técnica é que a Metaplasia Acinar-para-Ductal pode ser vista em tempo real e estudos de sinalização celular podem ser realizados. Para dissecar o pâncreas de um rato eutanizado, primeiro fixar as patas do mouse na tampa do poliestireno, orientando-o para que a cauda fique de frente para o pesquisador e pulverize o abdômen com 70% de etanol.
Use fórceps autoclavados para levantar a pele e a pele na linha média, e com uma tesoura autoclavada, faça uma incisão através da pele e da pele desde a abertura uretracicra até a área da caixa torácica do diafragma. Faça incisões adicionais à esquerda e à direita para cortar a pele e a pele, criando uma visão clara da cavidade abdominal. Em seguida, corte no revestimento peritoneal, no meio e à direita e à esquerda e puxe-o para longe dos órgãos.
Use os fórceps para levantar os intestinos e movê-los para o lado esquerdo do mouse, criando espaço para ver o pâncreas rosa claro preso ao baço escuro, vermelho e oval. O tecido pancreático terá textura macia e esponjosa. Corte o pâncreas, que corre ao longo do estômago, entrelaçando-se com os intestinos.
Separe o baço do pâncreas e coloque o pâncreas em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS, com uma vez estreptomicina de penicilina e transfisculha e transfira-o para o capô de fluxo laminar. Despeje o conteúdo do tubo em um barco de pesagem vazio e use fórceps para lavar o pâncreas rodopiando-o. Em seguida, use os fórceps para mover o pâncreas para um segundo barco de pesagem contendo HBSS com estreptomicina de penicilina e lavar novamente girando.
Mova o pâncreas para o terceiro barco de pesagem contendo HBSS com estreptomicina de penicilina e comece a cortar o pâncreas em pedaços de cinco milímetros ou menores. Para despejar o conteúdo do barco de pesagem em um tubo fresco de 50 mililitros, primeiro use os fórceps para mover os pedaços do pâncreas para dentro do líquido enquanto o barco está sendo derrubado. Uma vez que as peças não estejam mais presas ao barco, despeje seu conteúdo no tubo.
Pegue os pedaços restantes com os fórceps e lave os fórceps no tubo. Depois de centrifuging o tubo a 931 vezes gravidade a quatro graus Celsius por dois minutos, use uma pipeta de cinco mililitros para remover o HBSS e qualquer gordura flutuante. Adicione cinco mililitros de colagenase diluídos no HBSS.
Feche o tubo e certifique-se de uma tampa selada enrolando o tubo em filme de parafina de plástico. Coloque-o em uma incubadora, tremendo a 220 RPM a 37 graus Celsius por 20 minutos. O que produzirá a solução turva, e alguns pedaços de tecido restantes.
Para parar a dissociação, coloque o tubo no gelo e adicione cinco mililitros de HBSS frios com 5%FBS. Depois de centrifugar a 931 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por dois minutos, remova o supernatante usando uma pipeta de cinco mililitros. Suspenda novamente a pelota em 10 mililitros de HBSS com 5% de FBS, e centrífugue novamente em 931 vezes a gravidade por dois minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante usando uma pipeta de cinco mililitros e repita esta etapa com outros 10 mililitros de HBSS com 5%FBS. Em seguida, suspenda novamente a pelota em cinco mililitros de HBSS com 5%FBS. Use uma pipeta P1000 para filtrar a suspensão celular um mililitro de cada vez através de uma malha de 500 micrômetros em um tubo de 50 mililitros.
Para lavar todas as células pancreáticas restantes através da malha, adicione mais cinco mililitros de HBSS com 5% de FBS. Em seguida, use uma pipeta P1000 para passar este filtrado um mililitro de cada vez através da malha de 105 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Pipete suavemente esta suspensão celular em um tubo de 50 mililitros contendo HBSS com 30% de FBS, que formará uma camada de suspensão celular na parte superior.
Centrifugar esta suspensão celular a 233 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por dois minutos e remover o supernante. Suspenda a pelota contendo as células Acinar em uma vez o meio completo de Waymouth. Uma vez que um pâncreas é suficiente para duas infecções virais, divida a suspensão celular entre as tampas de duas placas de 35 milímetros, o que permite a infecção na suspensão.
Para infecção adenoviral, adicione o vírus a uma diluição de 1/1000 na tampa de cada placa e redemoinho. Coloque as placas em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Gire a cada 15 minutos durante a primeira hora e continue a incubação por mais duas horas.
Para fazer um gel de colágeno, combine sete mililitros de colágeno de cauda de rato tipo um, 700 microliters de 10 vezes o médio waymouth e 466,6 microliters de 0,34 hidróxido de sódio molar em um tubo de 50 mililitros no gelo para fazer gel de colágeno. Em um tubo de 50 mililitros, misture igualmente os volumes de suspensão celular e gel de colágeno após três horas de incubação e misture suavemente. Placa 2000 microliters, um bem de cada vez em uma placa de seis poços, mantendo a placa no gelo e redemoinho para distribuir uniformemente a camada celular de colágeno.
Para solidificar o meio, incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, adicione 1,5 mililitros por poço de uma vez o meio completo de Waymouth com estímulos ou inibidores desejados. Mude o meio no dia seguinte e, em seguida, a cada dois dias.
Dependendo do estímulo utilizado, pode-se observar metaplasia acinar-ductal ou ADM entre o terceiro e o quinto dia. 24 horas após a infecção com adenovírus GFP, imagens de células embutidas na matriz de membrana de colágeno ou porão, mostraram que a infecção era eficiente. Aos cinco dias após a infecção, as células embutidas no colágeno formaram estruturas semelhantes a dutos quando estimuladas com 50 nanogramas por mililitro de TGF alfa.
Células embutidas na matriz da membrana do porão formaram estruturas semelhantes a dutos na ausência de um estímulo aos cinco dias após a infecção. Considerando que dutos maiores foram formados em estimulação com 50 nanogramas por mililitro de TGF alfa. Um dos pontos mais críticos do protocolo é o comprimento da digestão da colagemnase.
A digestão adequada é indicada por uma solução turva e poucos pedaços de tecido restantes.
