Protokolümüz Acinar-to-Duktal Metaplazi doğrudan görselleştirme sunuyor ve ektotik uygulanan faktörler veya protein modülasyonu bu sürece katkısı çalışma sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı Acinar-to-Duktal Metaplazi gerçek zamanlı olarak görülebilir ve hücre sinyalizasyon çalışmaları yapılabilir olmasıdır. Bir ötenazi fareden pankreas incelemek için, ilk polistiren kapağına farenin pençeleri pin, kuyruk araştırmacı bakan ve% 70 etanol ile karın sprey böylece yönlendirme.
Orta hatta kürk ve deri kaldırmak için otoklav forseps kullanın, ve otoklavlı makas ile, diyafram göğüs kafesi alana üretral açılması kürk ve deri ile bir kesi yapmak. Sol ve sağ kürk ve deri kesmek için ek kesiler olun, karın boşluğu net bir görünüm oluşturma. Daha sonra, periton astarı, aşağı orta ve sağ ve sol ve organlardan çekin kesti.
Bağırsakları kaldırmak ve farenin sol tarafına taşımak için forseps kullanın, koyu, kırmızı, oval dalak bağlı açık pembe pankreas görmek için alan oluşturarak. Pankreas dokusu yumuşak olacak, süngerimsi doku. Pankreas kesip, mide boyunca uzanan, bağırsakile iç içe.
Pankreas tan dalak ayırın ve HBSS 10 mililitre içeren bir 50 mililitre tüp pankreas yerleştirin, bir kez penisilin streptomisin ile ve laminar akış kaputuna aktarın. Boş bir tartma tekne içine tüp içeriğini dökün ve girdap tarafından pankreas yıkamak için forceps kullanın. Sonra, penisilin streptomisin ile HBSS içeren ikinci bir tartma tekne pankreas taşımak için çökezlemek ve girdap tarafından tekrar yıkayın.
Penisilin streptomisin ile HBSS içeren üçüncü tartmak tekne pankreas taşıyın ve beş milimetre veya daha küçük parçalar halinde pankreas kesme başlar. Taze bir 50 mililitrelik tüp içine tartma tekne içeriğini dökmek için, ilk tekne uçlu ediliyor gibi sıvı içine pankreas parçaları taşımak için çerkezlik kullanın. Parçalar tekneye artık bağlanmadıktan sonra içindekileri tüpe dökün.
Geri kalan parçaları forceps ile toplayın ve tüpteki pikileri yıkayın. Tüpü 931 kez yerçekimini dört santigrat derecede iki dakika santrifüj ettikten sonra, HBSS'yi ve yüzen yağları çıkarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. HBSS seyreltilmiş kollajenaz beş mililitre ekleyin.
Tüpü kapatın ve tüpü plastik parafin filme sararak kapalı bir kapak sağlayın. 220 RPM'de 37 derecede 20 dakika sallayarak bir kuvöze yerleştirin. Bu da bulanık çözeltiyi ve kalan birkaç doku parçasını verecek.
Dissociation durdurmak için, buz üzerine tüp yerleştirin ve% 5 FBS ile soğuk HBSS beş mililitre ekleyin. İki dakika boyunca dört santigrat derecede 931 kez yer çekiminde santrifüj yaptıktan sonra, beş mililitrelik pipet kullanarak süpernatantı çıkarın. Peleti 10 mililitre HBSS'de %5 FBS ile yeniden askıya alın ve 4 santigrat derecede iki dakika boyunca 931 kat daha fazla yer çekiminde tekrar santrifüj edin.
Beş mililitrelik pipet kullanarak süpernatant çıkarın ve 5% FBS ile HBSS başka bir 10 mililitre ile bu adımı tekrarlayın. Daha sonra peleti %5 FBS ile beş mililitre HBSS cinsinden yeniden askıya alın. 50mililitrelik bir tüp içine 500 mikrometre örgü ile bir seferde bir mililitre hücre süspansiyon filtrelemek için bir P1000 pipet kullanın.
Mesh yoluyla kalan pankreas hücreleri yıkamak için, 5% FBS ile HBSS ek beş mililitre ekleyin. Daha sonra bir P1000 pipet 50 mililitrelik bir tüp içine 105 mikrometre örgü ile bir seferde bir mililitre geçmek için kullanın. Yavaşça pipet bu hücre süspansiyon 50 mililitrelik tüp içine HBSS içeren 30% FBS, hangi üst hücre süspansiyon bir tabaka oluşturacaktır.
Bu hücre süspansiyonuna 233 kat yerçekimini dört santigrat derecede iki dakika lığına santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Bir kez Waymouth tam orta Acinar hücreleri içeren pelet yeniden askıya. Bir pankreas iki viral enfeksiyonlar için yeterli olduğundan, süspansiyon enfeksiyon sağlar iki 35 milimetreplaka, kapakları arasında hücre süspansiyon bölünmüş.
Adenoviral enfeksiyon için, her plaka ve girdap kapağına 1/1000 seyreltme de virüs ekleyin. Plakaları 37 santigrat derece ve %5 CO2'de bir hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. İlk saat için her 15 dakikada bir girdap ve ek iki saat kuluçka devam edin.
Bir kollajen jel yapmak için, tip bir sıçan kuyruk kollajen yedi mililitre birleştirmek, 10 kez Waymouth orta 700 mikrolitre ve 466.6 mikrolitre 0.34 molar sodyum hidroksit buz üzerinde 50 mililitrelik tüp kollajen jel yapmak için. 50 mililitrelik bir tüp, hücre süspansiyon ve kollajen jel eşit hacimlerde üç saat kuluçka sonra birleştirmek ve yavaşça karıştırın. Plaka 2000 mikrolitre, bir de altı iyi plaka bir seferde buz üzerinde plaka tutarken ve eşit kollajen hücre tabakası dağıtmak için girdap.
Ortamı sağlamlaştırmak için, 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le 30 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın. Sonra istenilen uyarıcı veya inhibitörleri ile bir kez Waymouth tam orta iyi başına 1,5 mililitre ekleyin. Ertesi gün ve sonra her gün orta değiştirin.
Kullanılan uyarıcıya bağlı olarak, Acinar-to-Duktal Metaplazi veya ADM üçüncü gün ile beşinci gün arasında gözlenebilir. 24 saat sonrası GFP adenovirüs ile enfeksiyon sonrası, kollajen veya bazal membran matris gömülü hücrelerin görüntüleri, enfeksiyon etkili olduğunu gösterdi. Beş gün sonra enfeksiyon, kollajen gömülü hücreler TGF alfa mililitre başına 50 nanogram ile uyarıldığında kanal benzeri yapılar oluşturdu.
Bazal membran matrisine gömülü hücreler, enfeksiyon sonrası beş gün içinde bir uyarıcının yokluğunda kanal benzeri yapılar oluşturmuşlar. Daha büyük kanallar TGF alfa mililitre başına 50 nanogram ile stimülasyon üzerine kuruldu. Protokoldeki en kritik noktalardan biri kollajenaz sindirim uzunluğudur.
Uygun sindirim bulanık bir çözelti ve birkaç kalan doku parçaları ile gösterilir.
