הפרוטוקול שלנו מציע הדמיה ישירה של Acinar-to-Ductal Metaplasia ומאפשר לחקור את התרומה של גורמים מנוהלים באופן חוץ רחמי או אפנון חלבון לתהליך זה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי Acinar-to-Ductal Metaplasia ניתן לראות בזמן אמת מחקרי איתות התא יכול להתבצע. כדי לנתח את הלבלב מעכבר המתת דם, הצמד תחילה את כפות העכבר למכסה הפוליסטירן, וכוון אותו כך שהזנב פונה אל החוקר וריסס את הבטן ב-70% אתנול.
השתמש מלקחיים autoclaved כדי להרים את הפרווה והעור בקו האמצע, ועם מספריים autoclaved, לעשות חתך דרך הפרווה והעור מהפתח השופכה לאזור כלוב צלעות הסרעפת. בצע חתכים נוספים משמאל ומימין כדי לחתוך את הפרווה והעור, יצירת תצוגה ברורה של חלל הבטן. לאחר מכן, חותכים לתוך הציפוי הצפי, באמצע ובימין ובשמאל ומרחיקים אותו מהאיברים.
השתמש במטסים כדי להרים את המעיים ולהזיז אותם לצד השמאלי של העכבר, יצירת מקום לראות את הלבלב ורוד בהיר מחובר הטחול הכהה, אדום, אליפסה. רקמת הלבלב תהיה רכה, מרקם ספוגי. חותכים את הלבלב, אשר פועל לאורך הבטן, משתלב עם המעיים.
מפרידים את הטחול מהלבלב ומ מניחים את הלבלב בצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של HBSS, עם 1 פעמים פניצילין סטרפטומיצין ולהעביר אותו למכסה המנוע לזרימת למינאר. יוצקים את תכולת הצינור לתוך סירת שקילה ריקה ולהשתמש מטליות לשטוף את הלבלב על ידי מערבולת זה. לאחר מכן, להשתמש במטסים כדי להזיז את הלבלב לסירה שקילה שנייה המכילה HBSS עם פניצילין סטרפטומיצין ולשטוף שוב על ידי מערבולת.
מעבירים את הלבלב לסירת השקילה השלישית המכילה HBSS עם פניצילין סטרפטומיצין ומתחילים לחתוך את הלבלב לחמישה מילימטרים או לחתיכות קטנות יותר. כדי לשפוך את תכולת הסירה לשקול לתוך צינור טרי 50 מיליליטר, תחילה להשתמש במקלות להעביר את חתיכות הלבלב לתוך הנוזל כמו הסירה היא להיות הטה. ברגע שהחתיכות כבר לא מחוברות לסירה, יוצקים את תכולתה לתוך הצינור.
לאסוף את כל החלקים הנותרים עם המדפים ולשטוף את המדפים בצינור. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 931 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, להשתמש פיפטה חמישה מיליליטר כדי להסיר את HBSS וכל שומן צף. מוסיפים חמישה מיליליטר של קולגן מדולל HBSS.
סגור את הצינור ולהבטיח מכסה אטום על ידי עטיפת הצינור בסרט פרפין פלסטיק. מניחים אותו באינקובטור, רועד ב 220 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. אשר יניב את הפתרון turbid, וכמה חתיכות רקמה שנותרו.
כדי לעצור את הדיסוציאציה, מניחים את הצינור על קרח ומוסיפים חמישה מיליליטר של HBSS קר עם 5%FBS. לאחר צנטריפוגה ב 931 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, להסיר את supernatant באמצעות פיפטה חמישה מיליליטר. להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של HBSS עם 5%FBS, ו צנטריפוגה שוב ב 931 פעמים כבידה במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את supernatant באמצעות פיפט חמישה מיליליטר ולחזור על שלב זה עם עוד 10 מיליליטר של HBSS עם 5%FBS. ואז להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של HBSS עם 5%FBS. השתמש P1000 פיפטה כדי לסנן את ההשעיה התא מיליליטר אחד בכל פעם דרך רשת 500 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר.
כדי לשטוף את כל תאי הלבלב הנותרים דרך רשת שינוי, להוסיף חמישה מיליליטר נוספים של HBSS עם 5%FBS. ואז להשתמש פיפטה P1000 כדי להעביר את הסינון הזה מיליליטר אחד בכל פעם דרך רשת 105 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר. בעדינות pipette מתלה תא זה לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל HBSS עם 30%FBS, אשר יהיה ליצור שכבה של השעיית תא בחלק העליון.
צנטריפוגה זה השעיה התא ב 233 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ולהסיר את supernatant. להשעות מחדש את גלולה המכילה את התאים Acinar באחד פעמים המדיום המלא של Waymouth. מאז לבלב אחד מספיק עבור שני זיהומים ויראליים, לפצל את ההשעיה התא בין המכסים של שתי צלחות 35 מילימטר, אשר מאפשר זיהום בהשעיה.
לזיהום אדנו-ויראלי, מוסיפים את הנגיף בדילול של 1/1000 למכסה של כל צלחת ומערבולת. מניחים את הצלחות באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. מערבלים כל 15 דקות במשך השעה הראשונה וממשיכים את הדגירה במשך שעתיים נוספות.
כדי להפוך קולגן ג'ל, לשלב שבעה מיליליטר של קולגן זנב עכברוש אחד, 700 microliters של 10 פעמים בינוני של Waymouth ו 466.6 microliters של 0.34 נתרן הידרוקסידי טוחן בצינור 50 מיליליטר על הקרח כדי להפוך קולגן ג'ל. בצינור 50 מיליליטר, לשלב כמויות שוות של השעיית תאים וג'ל קולגן לאחר שלוש שעות דגירה בעדינות לערבב. צלחת 2000 microliters, אחד גם בכל פעם בצלחת שש באר תוך שמירה על הצלחת על קרח מערבולת כדי להפיץ באופן שווה את שכבת תא הקולגן.
כדי לחזק את המדיום, להחרים את הצלחת באינקובטור תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיליליטר ל-well של המדיום השלם של Waymouth עם הגירוי או המעכבים הרצויים. שנה את המדיום למחרת ולאחר מכן כל יומיים.
בהתאם לגירוי המשמש, Acinar-to-Ductal Metaplasia או ADM ניתן לראות בין היום השלישי ליום החמישי. 24 שעות לאחר ההדבקה עם אדנווירוס GFP, תמונות של תאים מוטבעים קולגן או מטריצת קרום מרתף, הראה כי זיהום היה יעיל. בחמישה ימים לאחר זיהום, תאים מוטבעים קולגן נוצר מבנים דמויי צינור כאשר מגורה עם 50 ננוגרם למיליליטר של אלפא TGF.
תאים המוטבעים במטריצת קרום מרתף יצרו מבנים דמויי צינור בהיעדר גירוי בחמישה ימים לאחר ההדבקה. בעוד צינורות גדולים יותר נוצרו על גירוי עם 50 ננוגרם למיליליטר של אלפא TGF. אחת הנקודות הקריטיות ביותר בפרוטוקול היא אורך עיכול הקולגנס.
עיכול נכון מסומן על ידי פתרון עגוע וכמה חתיכות רקמה שנותרו.
