Unser Protokoll bietet eine direkte Visualisierung der Acinar-zu-Ductal Metaplasie und ermöglicht die Untersuchung des Beitrags von ektopisch verabreichten Faktoren oder Proteinmodulation zu diesem Prozess. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Acinar-zu-Ductal Metaplasie in Echtzeit betrachtet werden kann und Zellsignalstudien durchgeführt werden können. Um die Bauchspeicheldrüse von einer eingeschläferten Maus zu sezieren, heften Sie zuerst die Pfoten der Maus an den Polystyroldeckel, orientieren Sie sie so, dass der Schwanz dem Forscher zugewandt ist, und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
Verwenden Sie autoklavierte Zangen, um das Fell und die Haut an der Mittellinie zu heben, und mit autoklavierter Schere, machen Sie einen Schnitt durch das Fell und die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Zwerchfell Rippenkäfigbereich. Machen Sie zusätzliche Einschnitte nach links und rechts, um das Fell und die Haut zu schneiden, wodurch eine klare Sicht auf die Bauchhöhle. Dann in die Peritoneal-Futter schneiden, in der Mitte und nach rechts und links und ziehen Sie es weg von den Organen.
Verwenden Sie die Zange, um den Darm zu heben und sie auf die linke Seite der Maus zu bewegen, wodurch Platz geschaffen wird, um die hellrosa Bauchspeicheldrüse zu sehen, die an der dunklen, roten, ovalen Milz befestigt ist. Das Bauchspeicheldrüsengewebe wird eine weiche, schwammige Textur haben. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse, die entlang des Magens läuft, inVerbindung mit dem Darm.
Trennen Sie die Milz von der Bauchspeicheldrüse und legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Rohr mit 10 MilliliterHBSS, mit einem Mal Penicillin Streptomycin und übertragen Sie es auf die laminare Strömungshaube. Gießen Sie den Inhalt des Rohres in ein leeres Wägeboot und verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse zu waschen, indem Sie sie wirbeln. Dann verwenden Sie die Zange, um die Bauchspeicheldrüse zu einem zweiten Wägeboot mit HBSS mit Penicillin Streptomycin zu bewegen und wieder durch Wirbelwaschen zu waschen.
Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse auf das dritte Wägeboot mit HBSS mit Penicillin Streptomycin und beginnen Sie, die Bauchspeicheldrüse in fünf Millimeter oder kleinere Stücke zu schneiden. Um den Inhalt des Wägebootes in ein frisches 50-Milliliter-Rohr zu gießen, verwenden Sie zuerst die Zange, um die Bauchspeicheldrüsenstücke in die Flüssigkeit zu bewegen, während das Boot gekippt wird. Sobald die Teile nicht mehr am Boot befestigt sind, gießen Sie ihren Inhalt in die Röhre.
Nehmen Sie alle verbleibenden Teile mit den Zangen auf und waschen Sie die Zange im Rohr. Nachdem Sie das Rohr zwei Minuten lang bei 931-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um den HBSS und jedes schwimmende Fett zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter Kollagenase in HBSS verdünnt.
Schließen Sie das Rohr und stellen Sie einen versiegelten Deckel sicher, indem Sie das Rohr in Eine Paraffinfolie aus Kunststoff einwickeln. Legen Sie es in einen Inkubator, schütteln Bei 220 RPM bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Das ergibt die trübe Lösung und nur noch wenige Gewebestücke.
Um die Dissoziation zu stoppen, legen Sie die Röhre auf Eis und fügen Sie fünf Milliliter kalte HBSS mit 5%FBS hinzu. Nach der Zentrifugierung bei 931-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius für zwei Minuten, entfernen Sie den Überstand mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Das Pellet in 10 Milliliter HBSS mit 5%FBS wieder aufhängen und bei 931-facher Schwerkraft für zwei Minuten bei vier Grad Celsius wieder zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand mit einer Fünf-Milliliter-Pipette und wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren 10 MilliliterHBSS mit 5%FBS. Dann setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter HBSS mit 5%FBS wieder auf. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellsuspension jeweils einen Milliliter durch ein 500-Mikrometer-Netz in ein 50-Milliliter-Rohr zu filtern.
Um alle verbleibenden Bauchspeicheldrüsenzellen durch das Netz zu waschen, fügen Sie weitere fünf Milliliter HBSS mit 5%FBS hinzu. Verwenden Sie dann eine P1000 Pipette, um dieses Filtrat jeweils einen Milliliter durch das 105 Mikrometer-Netz in ein 50-Milliliter-Rohr zu leiten. Pipetten Sie diese Zellsuspension vorsichtig in ein 50-Milliliter-Rohr mit HBSS mit 30%FBS, das oben eine Schicht zellaufhängung bildet.
Zentrifugieren Sie diese Zellsuspension bei 233-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius für zwei Minuten und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet, das die Acinar-Zellen enthält, in einem kompletten Medium von Waymouth wieder auf. Da eine Bauchspeicheldrüse für zwei Virusinfektionen ausreicht, teilen Sie die Zellsuspension zwischen den Deckeln von zwei 35-Millimeter-Platten auf, was eine Infektion in der Suspension ermöglicht.
Bei einer adenoviralen Infektion fügen Sie das Virus mit einer Verdünnung von 1/1000 auf den Deckel jeder Platte und wirbeln. Legen Sie die Platten in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2. In der ersten Stunde alle 15 Minuten wirbeln und die Inkubation für weitere zwei Stunden fortsetzen.
Um ein Kollagen-Gel herzustellen, kombinieren Sie sieben Milliliter Rattenschwanzkollagen, 700 Mikroliter des 10-fachen Waymouth-Mediums und 466,6 Mikroliter 0,34 Mol-Natriumhydroxid in einer 50-Milliliter-Röhre auf Eis, um Kollagengel herzustellen. In einem 50-Milliliter-Rohr, kombinieren gleiche Volumina von Zellsuspension und Kollagen-Gel nach drei Stunden Inkubation und sanft mischen. Platte 2000 Mikroliter, einer gut nach dem anderen in einer sechs Brunnenplatte, während die Platte auf Eis zu halten und wirbeln, um gleichmäßig die Kollagen-Zellschicht zu verteilen.
Um das Medium zu erstarren, inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten. Dann fügen Sie 1,5 Milliliter pro Brunnen von einem Mal Waymouth s komplettes Medium mit gewünschten Stimulus oder Inhibitoren. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag.
Je nach verwendeter Stimulus kann Acinar-to-Ductal Metaplasia oder ADM zwischen Tag drei und Tag fünf beobachtet werden. 24 Stunden nach der Infektion mit GFP-Adenovirus, Bilder von Zellen in Kollagen oder Keller Membran Matrix eingebettet, zeigte, dass die Infektion effizient war. Fünf Tage nach der Infektion bildeten in Kollagen eingebettete Zellen kanalähnliche Strukturen, wenn sie mit 50 Nanogramm pro Milliliter TGF-Alpha stimuliert wurden.
Zellen, die in die Kellermembranmatrix eingebettet sind, bildeten kanalähnliche Strukturen, wenn an fünf Tagen nach der Infektion kein Stimulus zur Folge hatte. Während größere Kanäle bei Stimulation mit 50 Nanogramm pro Milliliter TGF alpha gebildet wurden. Einer der kritischsten Punkte im Protokoll ist die Länge der Kollagenaseverdauung.
Die richtige Verdauung wird durch eine trübe Lösung und wenige verbleibende Gewebestücke angezeigt.
