Ce protocole est significatif parce qu’il permet la séparation et l’isolement de deux lignées cellulaires musculaires lisses, les cellules myoepithelial et les péricytes. Cette méthode combine l’étiquetage génétique des cellules musculaires lisses par l’intermédiaire de marqueurs de surface cellulaire pour purifier les populations de cellules myoepithelial et péricytes. Ce protocole permet de comparer la fonction et les capacités régénératrices des cellules myoepithelial saines et malades et de traiter ces cellules pour des études d’expression génétique.
Les cellules myoepithelial existent dans d’autres glandes exocrines telles que le mammaire, la salivaire, et le pancréas, qui permet à ce protocole d’être adapté par l’isolement des cellules myoepithelial et des péricytes de n’importe quel autre tissu. Pour étiqueter l’actine alpha lisse de muscle ou les cellules exprimant de SMA, injectez trois à quatre semaines-vieux tamoxifen-inducible alpha SMA conduit souris reporter avec 100 microlitres de tamoxifène par 20 grammes de poids corporel intraperitoneally une fois par jour pendant deux jours. Pour la collecte lacrymale de glande, deux à trois jours après la dernière injection, utilisez des pinces à épiler pour tirer doucement une glande tout en grattant le tissu conjonctif autour de la glande avec la pointe pointue d’une paire de petits ciseaux pour libérer la glande.
Lorsque les glandes lacrymales et parotides ont été séparées, utilisez des ciseaux pour couper la glande lacrymale et placer les glandes dans un plat de 35 millimètres avec deux millilitres de PBS froid sur la glace. Placez le plat sous un microscope disséquant et coupez les graisses environnantes et les tissus conjonctifs. Retirez ensuite la capsule lacrymale de glande avec deux forceps.
Lorsque toutes les glandes ont été récoltées, vérifiez un petit morceau de tissu au microscope fluorescent pour confirmer l’étiquetage cellulaire. Pour préparer une suspension à cellule unique, transférez toutes les glandes lacrymales dans un plat de 35 millimètres contenant 0,5 millilitre de milieu de digestion à température ambiante et utilisez de petits ciseaux pour hacher les glandes en morceaux carrés de 0,2 à un micromètre. À l’aide d’une pointe de filtre à pipette à alésage large, transférer le tissu haché dans un tube à fond rond de deux millilitres et porter le volume dans le tube à deux millilitres avec un milieu de digestion.
Inverser le tube pour mélanger, et placer le tube dans un incubateur de 37 degrés Celsius secouant pendant 90 minutes à 100 à 120 rotations par minute. Toutes les 30 minutes triturer lentement les morceaux de glande 20 à 30 fois en utilisant 1000 conseils de filtre microlitres avec une taille d’alésage décroissante. À la fin de chaque trituration, inspecter un aliquot de 10 microlitres au microscope à la recherche de grappes.
Après 90 minutes passer l’échantillon deux à trois fois à travers une aiguille de seringue à insuline pour libérer davantage les cellules en suspension et transférer la solution cellulaire à un tube de 15 millilitres. Ajouter le type moyen de blocage 1 à un total de cinq millilitres et mélanger le tube deux à trois fois par inversion. Passer les cellules à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres, et laver la passoire avec un millilitre de blocage de type moyen 1, avant de forcer les cellules à travers le filtre une fois de plus.
Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et réutilisez la pastille en deux millilitres de blocage de type moyen 2. Transférer les cellules dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez les cellules en un millilitre de solution Accutase pour une incubation de deux à trois minutes à 37 degrés Celsius et 100 à 120 rotations par minute.
À la fin de l’incubation, transférer les cellules dans un tube de 50 millilitres et ajouter jusqu’à 10 millilitres de blocage de type moyen 1. Après centrifugation resuspendre les cellules en six millilitres de milieu de récupération pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, vérifiez un échantillon de 10 microlitres au microscope pour assurer une dissociation complète des cellules.
Après le comptage, recueillir les cellules par centrifugation. Pour tacher les cellules pour le tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS, ajouter jusqu’à cinq fois 10 aux cinq cellules par tube de deux millilitres contenant 400 microlitres de tampon FACS et ajouter cinq microlitres de Brilliant Violet 421 anti souris CD326 et 0,5 microlitres de Ghost Red 780 Viability Dye. Après un mélange complet, envelopper les tubes de papier d’aluminium pendant une incubation de 45 minutes à 4 degrés Celsius avec rotation.
À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les granulés en un millilitre de tampon FACS par échantillon. Transférez les échantillons de cellules à des tubes FACS individuels de cinq millilitres sur la glace et ajustez la compensation à l’aide de commandes de couleur unique. Puis trier les cellules à 20 livres par pouce carré à travers une buse de 100 micromètres.
Les péricytes microvasculaires se développent autour des parois des capillaires et démontrent une forme carrée. Les cellules myoepithelial entourent l’acini sécrétaire lacrymal, ont de longs processus, et occupent une zone relativement grande. Ici, les cellules dissociées d’une glande lacrymale en préparation pour le tri cellulaire fluorescence-activé, comme juste démontré, sont montrées.
Pour le tri cytométrique d’écoulement des cellules myoepithelial et des péricytes les cellules devraient d’abord être gated par leurs secteurs avant et latéraux-dispersés avant d’exclure n’importe quel doublets. Après l’exclusion des cellules mortes, des échantillons de contrôle sont utilisés pour déterminer le bruit de fond et établir une compensation appropriée pour une séparation optimale entre les signaux. N’oubliez pas de garder le nombre de glandes et le volume moyen de digestion tel que décrit dans le protocole, et de vérifier l’efficacité de la digestion des tissus à toutes les étapes.
Les cellules isolées peuvent être utilisées pour plusieurs applications en aval, y compris des expériences in vivo/in vitro, par exemple la culture cellulaire, la transplantation, la métabolomique, la protéomique et l’analyse à cellules individuelles.
