Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет разделение и изоляцию двух гладких линий мышечных клеток, миоэпителиальных клеток и перицитов. Этот метод сочетает в себе генетическую маркировку гладких мышечных клеток с помощью маркеров поверхности клеток для очистки популяций миоэпителиальных клеток и перицитов. Этот протокол позволяет сравнить функцию и регенеративные способности здоровых и больных миоэпителиальных клеток и обработку этих клеток для изучения экспрессии генов.
Миоэпителиальные клетки существуют в других экзокринных железах, таких как молочная железа, слюна и поджелудочная железа, что позволяет адаптировать этот протокол путем изоляции миоэпителиальных клеток и перицитов от любой другой ткани. Чтобы обозначить альфа гладкий мышечный актин или SMA экспресс-клеток, вводить от трех до четырех недель тамоксифен-неопружимый альфа SMA приводом репортер мышей с 100 микролитров тамоксифена на 20 граммов массы тела intraperitoneally один раз в день в течение двух дней. Для сбора лакримальной железы, через два-три дня после последней инъекции, используйте пинцет, чтобы осторожно тянуть одну железу и в то же время царапин соединительной ткани вокруг железы с острым кончиком ножниц, чтобы освободить железу.
Когда лакримальные и околоушные железы были разделены, используйте ножницы, чтобы вырезать лакримальной железы и поместить железы в 35-миллиметровое блюдо с двумя миллилитров холодного PBS на льду. Поместите блюдо под рассекающий микроскоп и обрезать любой окружающий жир и соединительной ткани. Затем удалите капсулу лакримальной железы двумя типсами.
Когда все железы были собраны, проверьте небольшой кусочек ткани под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить маркировку клеток. Чтобы подготовить одноклеточную суспензию, перенесите все лакримальные железы на 35-миллиметровую тарелку, содержащую 0,5 миллилитров среды комнатного пищеварения, и используйте небольшие ножницы, чтобы измельчить железы на 0,2-1 микрометр квадратных кусочков. Используя широкий кончик фильтра пипетки, перенесите рубленую ткань в двухми миллилитровую круглую нижнюю трубку и довнесите объем в трубке до двух миллилитров со средой пищеварения.
Переверните трубку, чтобы смешать, и поместите трубку в 37 градусов по Цельсию встряхивания инкубатор в течение 90 минут при 100 до 120 оборотов в минуту. Каждые 30 минут медленно тритурировать кусочки железы от 20 до 30 раз с помощью 1000 микролитров фильтр советы с уменьшением размера скважины. В конце каждой тритурации проинспектировать алицит 10 микролитров под микроскопом для кластеров.
Через 90 минут пройдите образец два-три раза через иглу инсулинового шприца, чтобы еще больше выпустить клетки в суспензию и перенести клеточный раствор в 15-миллилитровую трубку. Добавьте Blocking Medium Type 1 в общей сложности пять миллилитров и смешайте трубку два-три раза инверсией. Перейдите клетки через 70 микрометровый ситечко клетки в 50 миллилитровую трубку, и мыть ситечко с одним миллилитром блокирования среднего типа 1, прежде чем напрягать клетки через фильтр еще раз.
Затем соберите клетки путем центрифугации и повторно посовелите гранулы в два миллилитра блокирующего блокирующего среднего типа 2. Перенесите клетки в двухмилилитровую микроцентрифугную трубку и соберите клетки путем центрифугации. Переподходить клетки в один миллилитр раствора Accutase в течение двух-трех минут инкубации при 37 градусах по Цельсию и от 100 до 120 вращений в минуту.
В конце инкубации перенесите клетки в 50 миллилитровую трубку и добавьте до 10 миллилитров блокирующего среднего типа 1. После центрифугации повторного перерасхода клеток в шесть миллилитров восстановительной среды в течение 30 минут инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации проверьте 10 микролитров под микроскопом, чтобы обеспечить полную диссоциацию клеток.
После подсчета, собирать клетки центрифугации. Чтобы испачкать клетки для флуоресценции активированной сортировки клеток, или FACS, добавьте до пяти раз 10 к пяти клеткам на две миллилитровые трубки, содержащие 400 микролитров буфера FACS, и добавьте пять микролитров Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 и 0,5 микролитров Ghost Red 780 Viability Dye. После тщательного смешивания, оберните трубки фольгой в течение 45 минут инкубации при 4 градусах по Цельсию с вращением.
В конце инкубации соберите клетки путем центрифугации и повторно посовелите гранулы в один миллилитр буфера FACS на образец. Перенесите образцы клеток в отдельные пятими миллилитровые трубки FACS на льду и отрегулируйте компенсацию с помощью одного цветового контроля. Затем сортировать клетки на 20 фунтов на квадратный дюйм через 100 микрометров сопла.
Микрососудистые перициты развиваются вокруг стенок капилляров и демонстрируют квадратную форму. Миепителиальные клетки окружают лакримальные секреторные ацини, имеют длительные процессы и занимают относительно большую площадь. Здесь показаны клетки, отсоединенные от лакримальной железы в рамках подготовки к флуоресценции активированной сортировке клеток, как только что продемонстрировано.
Для потока цитометрической сортировки миоэпителиальных клеток и перицитов клетки должны быть сначала закрыты их вперед и боковой рассеяния областях, прежде чем исключать любые дублеты. После исключения мертвых клеток, контрольные образцы используются для определения фонового шума и установления надлежащей компенсации за оптимальное разделение между сигналами. Не забудьте сохранить количество желез и пищеварения среднего объема, как описано в протоколе, и проверить эффективность пищеварения тканей на всех этапах.
Изолированные клетки могут быть использованы для нескольких приложений вниз по течению, включая эксперименты in vivo/in vitro, например, клеточную культуру, трансплантацию, метаболомику, протеомику и одноклеточный анализ.
