Este protocolo é significativo porque permite a separação e isolamento de duas linhas de células musculares lisas, as células mioepitheliais e pericítas. Este método combina rotulagem genética de células musculares lisas através de marcadores de superfície celular para purificar populações de células mioepiteliais e pericítos. Este protocolo permite comparar a função e as habilidades regenerativas das células mioepitheliais saudáveis e doentes e processar essas células para estudos de expressão genética.
As células mioepitheliais existem em outras glândulas exócrinas como mamária, salivar e pâncreas, o que permite que este protocolo seja adaptado pelo isolamento de células mioepiteliais e pericítos de qualquer outro tecido. Para rotular as células de expressão do músculo alfa liso ou SMA, injete de três a quatro semanas de idade, camundongos repórteres alfa sma conduzidos por tamoxifen com 100 microliters de tamoxifen por 20 gramas de peso corporal intraperitonel uma vez por dia durante dois dias. Para a coleta de glândula lacrimal, dois a três dias após a última injeção, use pinças para puxar suavemente uma glândula e, ao mesmo tempo, coçar o tecido conjuntivo ao redor da glândula com a ponta afiada de um par de tesouras pequenas para libertar a glândula.
Quando as glândulas lacrimal e parótide forem separadas, use uma tesoura para cortar a glândula lacrimal e colocar as glândulas em um prato de 35 milímetros com dois mililitros de PBS frio no gelo. Coloque o prato sob um microscópio dissecando e corte qualquer gordura circundante e tecido conjuntivo. Em seguida, remova a cápsula da glândula lacrimal com dois fórceps.
Quando todas as glândulas tiverem sido colhidas, verifique um pequeno pedaço de tecido sob um microscópio fluorescente para confirmar a rotulagem celular. Para preparar uma suspensão unicelular, transfira todas as glândulas lacrimais para um prato de 35 milímetros contendo 0,5 mililitros de meio de digestão de temperatura ambiente e use pequenas tesouras para picar as glândulas em pedaços quadrados de 0,2 a um micrômetro. Usando uma ponta de filtro de pipeta de furo largo, transfira o tecido picado em um tubo de fundo redondo de dois mililitros e leve o volume no tubo para dois mililitros com meio de digestão.
Inverta o tubo para misturar, e coloque o tubo em uma incubadora de agitação de 37 graus celsius por 90 minutos a 100 a 120 rotações por minuto. A cada 30 minutos, tritura lentamente as peças da glândula 20 a 30 vezes usando 1000 pontas de filtro de microliter com um tamanho de furo diminuindo. No final de cada trituração, inspecione uma alíquota de 10 microliter sob um microscópio para agrupamentos.
Após 90 minutos passe a amostra duas a três vezes através de uma agulha de seringa de insulina para liberar ainda mais as células em suspensão e transferir a solução celular para um tubo de 15 mililitros. Adicione o tipo médio de bloqueio 1 a um total de cinco mililitros e misture o tubo duas a três vezes por inversão. Passe as células através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros, e lave o coador com um mililitro de Bloqueio Médio Tipo 1, antes de esticar as células através do filtro mais uma vez.
Em seguida, colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em dois mililitros de bloqueio de bloqueio médio tipo 2. Transfira as células para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e colete as células por centrifugação. Resuspenque as células em um mililitro de solução accutase para uma incubação de dois a três minutos a 37 graus celsius e 100 a 120 rotações por minuto.
No final da incubação, transfira as células para um tubo de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de Bloqueio Médio Tipo 1. Após a centrifugação resuspend as células em seis mililitros de meio de recuperação para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, verifique uma amostra de 10 microliter sob o microscópio para garantir a dissociação celular completa.
Após a contagem, colete as células por centrifugação. Para colorir as células para classificação celular ativada pela Fluorescência, ou FACS, adicione cinco vezes 10 às cinco células por dois tubos de mililitro contendo 400 microliters de tampão FACS e adicione cinco microliters de Brilhante Violet 421 anti-mouse CD326 e 0,5 microliters de Ghost Red 780 Viability Dye. Após a mistura completa, enrole os tubos com papel alumínio para uma incubação de 45 minutos a 4 graus celsius com rotação.
No final da incubação, colete as células por centrifugação e resuspenda as pelotas em um mililitro de tampão FACS por amostra. Transfira as amostras de células para tubos FACS individuais de cinco mililitros no gelo e ajuste a compensação usando controles de cor única. Em seguida, classifique as células a 20 libras por polegada quadrada através de um bocal de 100 micrômetros.
Pericítos microvasculares se desenvolvem ao redor das paredes dos capilares e demonstram uma forma quadrada. As células mioepitheliais circundam o acini lacrimal secretory, têm processos longos e ocupam uma área relativamente grande. Aqui, células dissociadas de uma glândula lacrimal em preparação para a Classificação Celular ativada pela Fluorescência, como apenas demonstrado, são mostradas.
Para a triagem citométrica de fluxo de células mioepitheliais e pericítes as células devem primeiro ser fechadas por suas áreas de dispersão dianteira e lateral antes de excluir quaisquer doublets. Depois de gating para excluir as células mortas, amostras de controle são usadas para determinar o ruído de fundo e estabelecer uma compensação adequada para uma separação ideal entre os sinais. Lembre-se de manter o número das glândulas e o volume médio de digestão conforme descrito no protocolo, e verificar a eficiência da digestão tecidual em todas as etapas.
As células isoladas podem ser usadas para múltiplas aplicações a jusante, incluindo experimentos in vivo/in vitro, por exemplo cultura celular, transplante, metabolômica, proteômica e análise unicelular.
