Questo protocollo è significativo perché consente la separazione e l'isolamento di due linee cellulari muscolari lisce, le cellule mioepiteliali e i periciti. Questo metodo combina l'etichettatura genetica delle cellule muscolari lisce attraverso marcatori di superficie cellulare per purificare le popolazioni di cellule mioepiteliali e periciti. Questo protocollo consente il confronto della funzione e delle capacità rigenerative delle cellule mioepiteliali sane e masticate e l'elaborazione di queste cellule per studi di espressione genica.
Le cellule mioepiteliali esistono in altre ghiandole esocrine come mammarie, salivari e pancreas, il che consente di adattare questo protocollo isolando cellule mioepiteliali e periciti da qualsiasi altro tessuto. Per etichettare l'actina muscolare liscia alfa o le cellule che esprimono SMA, iniettare topi reporter alfa inducibili alfa SMA da tre a quattro settimane con 100 microlitri di tamoxifene per 20 grammi di peso corporeo intraperitonealmente una volta al giorno per due giorni. Per la raccolta della ghiandola lacrimale, da due a tre giorni dopo l'ultima iniezione, utilizzare una pinzetta per tirare delicatamente una ghiandola e allo stesso tempo graffiare il tessuto connettivo intorno alla ghiandola con la punta affilata di un paio di piccole forbici per liberare la ghiandola.
Quando le ghiandole lacrimali e parotidi sono state separate, utilizzare le forbici per tagliare la ghiandola lacrimale e posizionare le ghiandole in un piatto di 35 millimetri con due millilitri di PBS freddo sul ghiaccio. Posizionare il piatto al microscopio di sezionamento e tagliare qualsiasi grasso circostante e tessuto connettivo. Quindi rimuovere la capsula della ghiandola lacrimale con due forcep.
Quando tutte le ghiandole sono state raccolte, controllare un piccolo pezzo di tessuto al microscopio fluorescente per confermare l'etichettatura cellulare. Per preparare una sospensione a cella singola, trasferire tutte le ghiandole lacrimali in un piatto da 35 millimetri contenente 0,5 millilitri di mezzo di digestione a temperatura ambiente e utilizzare piccole forbici per tritare le ghiandole in pezzi quadrati da 0,2 a un micrometro. Utilizzando una punta del filtro della pipetta a foro largo trasferire il tessuto tritato in un tubo a fondo tondo da due millilitri e portare il volume nel tubo a due millilitri con mezzo di digestione.
Invertire il tubo per mescolare e posizionare il tubo in un'incubatrice di scuotimento di 37 gradi Celsius per 90 minuti a 100-120 rotazioni al minuto. Ogni 30 minuti tritura lentamente i pezzi di ghiandola da 20 a 30 volte utilizzando punte filtranti da 1000 microliter con una dimensione di foro decrescente. Al termine di ogni triturazione, ispezionare un'aliquota di 10 microliter al microscopio per i cluster.
Dopo 90 minuti passare il campione da due a tre volte attraverso un ago della siringa per insulina per rilasciare ulteriormente le cellule in sospensione e trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere blocking medium type 1 a un totale di cinque millilitri e mescolare il tubo da due a tre volte per inversione. Passare le cellule attraverso un colino cellulare di 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri e lavare il colino con un millilitro di Blocking Medium Type 1, prima di sforzare le cellule attraverso il filtro ancora una volta.
Successivamente raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere il pellet in due millilitri di blocco di tipo medio bloccante 2. Trasferire le cellule in un tubo di microcentrifugo a due millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rimescolare le cellule in un millilitro di soluzione di Accutasi per un'incubazione da due a tre minuti a 37 gradi celsius e da 100 a 120 rotazioni al minuto.
Alla fine dell'incubazione, trasferire le cellule in un tubo da 50 millilitri e aggiungere fino a 10 millilitri di Blocking Medium Type 1. Dopo la centrifugazione rimospend le cellule in sei millilitri di mezzo di recupero per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, controllare un campione di 10 microliter al microscopio per garantire la completa dissociazione cellulare.
Dopo il conteggio, raccogliere le cellule per centrifugazione. Per macchiare le celle per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, o FACS, aggiungere fino a cinque volte 10 alle cinque celle per due tubi millilitri contenenti 400 microlitri di buffer FACS e aggiungere cinque microlitri di Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 e 0,5 microlitri di Ghost Red 780 Viability Dye. Dopo un'accurata miscelazione, avvolgere i tubi con un foglio per un'incubazione di 45 minuti a 4 gradi celsius con rotazione.
Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in un millilitro di tampone FACS per campione. Trasferire i campioni di cella su singoli tubi FACS a cinque millilitri su ghiaccio e regolare la compensazione utilizzando controlli a colori singoli. Quindi ordinare le celle a 20 libbre per pollice quadrato attraverso un ugello da 100 micrometri.
I periciti microvascolari si sviluppano attorno alle pareti dei capillari e dimostrano una forma quadrata. Le cellule mioepiteliali circondano gli acini lacrimali secretori, hanno processi lunghi e occupano un'area relativamente grande. Qui, vengono mostrate cellule dissociate da una ghiandola lacrimale in preparazione per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, come appena dimostrato.
Per lo smistamento citometrico del flusso delle cellule mioepiteliali e dei periciti, le cellule devono prima essere gated dalle loro aree di dispersione avanti e laterale prima di escludere eventuali doppietti. Dopo aver escluso le cellule morte, i campioni di controllo vengono utilizzati per determinare il rumore di fondo e per stabilire una compensazione adeguata per una separazione ottimale tra i segnali. Ricorda di mantenere il numero delle ghiandole e del volume medio di digestione come descritto nel protocollo e di controllare l'efficienza della digestione dei tessuti a tutti i passaggi.
Le cellule isolate possono essere utilizzate per molteplici applicazioni a valle, inclusi esperimenti in vivo/in vitro, ad esempio coltura cellulare, trapianto, metabolomica, proteomica e analisi a singola cellula.
