이 프로토콜은 두 개의 부드러운 근육 세포주, 근피세포 및 구막세포의 분리 및 분리를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 방법은 세포 표면 마커를 통해 매끄러운 근육 세포의 유전 라벨링을 결합하여 심근 세포 및 복막세포의 인구를 정화합니다. 이 프로토콜은 건강하고 병이 있는 심근 세포의 기능 및 재생 능력을 비교하고 유전자 발현 연구를 위해 이러한 세포를 처리할 수 있게 합니다.
근피성 세포는 유방, 타액 및 췌장과 같은 다른 외신 동맥에 존재하며, 이 프로토콜은 다른 조직에서 심근피성 세포 및 pericytes의 격리에 의해 적응될 수 있습니다. 알파 부드러운 근육 액틴 또는 SMA 발현 세포를 레이블을 지정하려면, 2일 동안 하루에 한 번 체중20그램당 100마이크로리터의 타목시펜을 가진 3~4주 된 타목시펜 유도 알파 SMA 구동 기자 마우스를 주입하십시오. 마지막 주사 후 2~3일 후에 는 핀셋을 사용하여 한 글선을 부드럽게 당기는 동시에 작은 가위 한 쌍의 날카로운 끝으로 선 주위의 결합 조직을 긁어 내어 선통을 풀어주세요.
라크라이말과 파로티드 땀샘이 분리되었을 때, 가위를 사용하여 라크라이피선을 자르고 땀샘을 얼음 위에 차가운 PBS 2 밀리리터가 있는 35mm 접시에 넣습니다. 해부 현미경 아래에 접시를 놓고 주변 지방 및 결합 조직을 다듬습니다. 그런 다음 두 개의 집게로 라크라이피 선 캡슐을 제거합니다.
모든 땀샘이 수확되었을 때, 형광 현미경의 밑에 조직의 작은 조각을 확인하여 세포 라벨링을 확인하십시오. 단일 셀 서스펜션을 준비하려면 모든 라크라이피 땀샘을 0.5 밀리리터의 실온 소화 매체를 포함하는 35mm 접시로 옮기고 작은 가위를 사용하여 땀샘을 0.2 내지 1 마이크로미터 평방 조각으로 다진다. 넓은 보어 파이펫 필터 팁을 사용하여 다진 조직을 2밀리리터 라운드 하단 튜브로 옮기고 튜브의 부피를 소화 배지로 두 밀리리터로 가져옵니다.
튜브를 혼합하여 반전시키고 튜브를 분당 100~120회전에서 90분 동안 37도 의 섭씨 흔들림 인큐베이터에 넣습니다. 30분마다 1000 마이크로리터 필터 팁을 사용하여 20~30회 글리드 조각을 천천히 세배로 세려줍니다. 각 트리튜션의 끝에서, 클러스터에 대한 현미경으로 10 마이크로 리터 알리쿼트검사.
90분 후 인슐린 주사기 바늘을 통해 샘플을 2~3회 전달하여 세포를 현탁액으로 방출하고 세포 용액을 15 밀리리터 튜브로 이송한다. 블로킹 미디엄 타입 1을 총 5밀리리터에 추가하고 반전으로 튜브를 2~3회 혼합합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 50 밀리리터 튜브로 세포를 통과하고, 필터를 통해 세포를 한 번 더 긴장하기 전에 차단 중간 유형 1의 1 밀리리터로 여과기를 세척합니다.
다음으로 원심분리에 의해 세포를 수집하고 차단 중간 유형 2의 두 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. Accutase 용액의 1 밀리리터에서 세포를 섭씨 37도에서 2~3분 동안, 분당 100~120회 회전으로 세포를 재연합니다.
인큐베이션이 끝나면 세포를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 차단 중간 유형 1의 최대 10 밀리리터를 추가합니다. 원심분리 후 실온에서 30분 동안 회복 배지의 6밀리리터에서 세포를 재연한다. 인큐베이션이 끝나면 현미경으로 10개의 미세리터 샘플을 확인하여 완전한 세포 해리를 보장합니다.
계산 후 원심 분리로 세포를 수집합니다. 형광 활성화 셀 선별, 또는 FACS에 대한 세포를 염색하려면, FACS 버퍼의 400 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 튜브 당 5 개의 세포에 최대 5 배 10을 추가하고 화려한 바이올렛 421 안티 마우스 CD326 및 유령 레드 780 생존 성 염료의 마이크로 리터 5 개를 추가합니다. 철저한 혼합 후 튜브를 45분간 호일로 감싸고 섭씨 4도에서 회전시 사용하세요.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 샘플 당 FACS 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 세포 샘플을 얼음에 있는 개별 5밀리리터 FACS 튜브로 옮기고 단일 색상 컨트롤을 사용하여 보상을 조정합니다. 그런 다음 100 마이크로 미터 노즐을 통해 평방 인치 당 20 파운드에서 세포를 정렬합니다.
미세 혈관 회분은 모세 혈관의 벽 주위에 개발하고 사각형 모양을 보여줍니다. 근피성 세포는 라크라이피 분비 아시니를 둘러싸고, 긴 과정을 가지고, 상대적으로 넓은 영역을 차지한다. 여기서, 형광 활성화 세포 분류를 준비하기 위해 라크라이피선으로부터 해리된 세포가 방금 입증된 바와 같이, 나타난다.
심근 세포및 회신세포의 유동 세포학적 분류를 위해 세포는 먼저 어떤 이중을 제외하기 전에 그들의 전진 및 측면 분산 영역에 의해 게이트되어야 한다. 죽은 세포를 배제하기 위해 게이팅 후, 제어 샘플은 배경 노이즈를 결정하고 신호 사이의 최적의 분리에 대한 적절한 보상을 설정하는 데 사용됩니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이 땀샘과 소화 중간 부피의 수를 유지하고 모든 단계에서 조직 소화의 효율을 확인하는 것을 기억하십시오.
상기 분리된 세포는 생체내/체외 실험을 포함하는 다중 다운스트림 적용, 예를 들어 세포 배양, 이식, 메타볼로믹스, 프로테오믹스 및 단세포 분석에 사용될 수 있다.
