Dieses Protokoll ist wichtig, weil es die Trennung und Isolierung von zwei glatten Muskelzelllinien, den myoepitheliale Zellen und Pericyten, ermöglicht. Diese Methode kombiniert die genetische Kennzeichnung glatter Muskelzellen über Zelloberflächenmarker, um Populationen von Myoepithelzellen und Pericyten zu reinigen. Dieses Protokoll ermöglicht den Vergleich der Funktion und der regenerativen Fähigkeiten gesunder und kranker Myoepithelzellen und die Verarbeitung dieser Zellen für Genexpressionsstudien.
Myoepithelzellen existieren in anderen exokrinen Drüsen wie Brust, Speichelundschaft und Bauchspeicheldrüse, wodurch dieses Protokoll durch Isolierung von Myoepithelzellen und Pericyten aus jedem anderen Gewebe angepasst werden kann. Um die Alpha glatten Muskel Actin oder SMA exzieren Zellen zu beschriften, injizieren drei bis vier Wochen alte Tamoxifen-induzierbare Alpha SMA angetrieben Reporter Mäuse mit 100 Mikroliter Tamoxifen pro 20 Gramm Körpergewicht intraperitoneally einmal täglich für zwei Tage. Für die lacrymale Drüsensammlung, zwei bis drei Tage nach der letzten Injektion, verwenden Sie eine Pinzette, um sanft eine Drüse zu ziehen, während sie gleichzeitig das Bindegewebe um die Drüse mit der scharfen Spitze einer kleinen Schere kratzen, um die Drüse zu befreien.
Wenn die lacrymalen und die Ohrspeicheldrüsen abgetrennt sind, verwenden Sie eine Schere, um die lakrymale Drüse herauszuschneiden und legen Sie die Drüsen in eine 35-Millimeter-Schale mit zwei Milliliterkalten PBS auf Eis. Legen Sie die Schale unter ein Sezieren mikroskopund schneiden Sie alle umgebenden Fette und Bindegewebe. Dann entfernen Sie die lakrymale Drüsenkapsel mit zwei Zangen.
Wenn alle Drüsen geerntet wurden, überprüfen Sie ein kleines Stück Gewebe unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Zellbeschriftung zu bestätigen. Zur Herstellung einer einzelzelligen Suspension alle lakrymalen Drüsen auf eine 35-Millimeter-Schale mit 0,5 MilliliterRaum-Temperatur-Verdauungsmedium übertragen und mit einer kleinen Schere die Drüsen in 0,2 bis ein Mikrometer quadratische Stücke zerkleinern. Mit einer Breitbohrpipettenfilterspitze das gehackte Gewebe in ein zwei Milliliter Rundbodenrohr übertragen und das Volumen im Rohr mit Verdauungsmedium auf zwei Milliliter bringen.
Invertieren Sie das Rohr zu mischen, und legen Sie das Rohr in einem 37 Grad Celsius Schüttel-Inkubator für 90 Minuten bei 100 bis 120 Umdrehungen pro Minute. Alle 30 Minuten trituieren die Drüsenstücke 20 bis 30 Mal mit 1000 Mikroliter Filterspitzen mit abnehmender Bohrungsgröße. Am Ende jeder Trituration, inspizieren Sie ein 10 Mikroliter Aliquot unter dem Mikroskop für Cluster.
Nach 90 Minuten die Probe zwei- bis dreimal durch eine Insulinspritze Nadel passieren, um die Zellen weiter in Suspension zu geben und die Zelllösung in eine 15 Milliliter Tube zu übertragen. Fügen Sie Blocking Medium Type 1 zu insgesamt fünf Millilitern hinzu und mischen Sie das Rohr zwei- bis dreimal durch Inversion. Übergeben Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr und waschen Sie das Sieb mit einem Milliliter Blocking Medium Type 1, bevor Sie die Zellen ein einziges Mal durch den Filter belasten.
Als nächstes sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in zwei Millilitern blockierender Blockierung Medium Typ 2 wieder auf. Übertragen Sie die Zellen in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Accutase-Lösung für eine zwei- bis dreiminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 100 bis 120 Umdrehungen pro Minute aus.
Übertragen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in ein 50-Milliliter-Rohr und addieren Sie bis zu 10 Milliliter Blocking Medium Type 1. Nach der Zentrifugation setzen Sie die Zellen in sechs Millilitern Erholungsmedium für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder auf. Überprüfen Sie am Ende der Inkubation eine 10-Mikroliter-Probe unter dem Mikroskop, um eine vollständige Zelldissoziation zu gewährleisten.
Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Um die Zellen für fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) zu färben, addieren Sie bis zu fünf mal 10 zellen pro Zwei-Milliliter-Röhre, die 400 Mikroliter FACS-Puffer enthält, und fügen Sie fünf Mikroliter Brilliant Violet 421 Anti-Maus-CD326 und 0,5 Mikroliter Ghost Red 780 Viability Dye hinzu. Nach gründlichem Mischen die Rohre mit Folie für eine 45-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius mit Rotation wickeln.
Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Pellets in einem Milliliter FACS-Puffer pro Probe wieder aufsetzen. Übertragen Sie die Zellproben auf einzelne fünf Milliliter FACS-Röhren auf Eis und passen Sie die Kompensation mit einfarbigen Kontrollen an. Sortieren Sie dann die Zellen mit 20 Pfund pro Quadratzoll durch eine 100-Mikrometer-Düse.
Mikrovaskuläre Pericyten entwickeln sich um die Wände von Kapillaren und zeigen eine quadratische Form. Myoepithelzellen umgeben die lakrymal ensekretorischen Acini, haben lange Prozesse und besetzen eine relativ große Fläche. Hier werden Zellen gezeigt, die sich von einer lakrymalen Drüse in Vorbereitung auf die fluorescence-aktivierte Zellsortierung dissoziierten, wie gerade gezeigt.
Für die zytometrische Sortierung von Myoepithelzellen und Pericyten sollten die Zellen zunächst durch ihre vorderen und seitlichen Streubereiche abgezäut werden, bevor Doublets ausgeschlossen werden. Nach dem Gating, um die abgestorbenen Zellen auszuschließen, werden Kontrollproben verwendet, um das Hintergrundrauschen zu bestimmen und eine angemessene Kompensation für eine optimale Trennung zwischen Signalen zu etablieren. Denken Sie daran, die Anzahl der Drüsen und Verdauung mittleres Volumen zu halten, wie im Protokoll beschrieben, und die Effizienz der Gewebeverdauung bei allen Schritten zu überprüfen.
Die isolierten Zellen können für mehrere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, einschließlich In-vivo/In-vitro-Experimenten, z. B. Zellkultur, Transplantation, Metabolomik, Proteomik und Einzelzellanalyse.
