このプロトコルは、2つの平滑筋細胞株、筋上皮細胞および心細胞の分離および単離を可能にするので重要である。この方法は、細胞表面マーカーを介して平滑筋細胞の遺伝的標識を組み合わせて、筋上皮細胞および心細胞の集団を精製する。このプロトコルは、健康で病気の筋上皮細胞の機能と再生能力を比較し、遺伝子発現研究のためにこれらの細胞を処理することを可能にする。
筋上皮細胞は乳腺、唾液、膵臓などの他の外分泌腺に存在し、このプロトコルは他の組織からの筋上皮細胞および近縁細胞の単離によって適応することを可能にする。アルファ平滑筋アクチンまたはSMA発現細胞にラベルを付けるには、3〜4週齢のタモキシフェン誘導性アルファSMA駆動レポーターマウスを、1日1回腹腔内に10グラムの体重100マイクロリットルのタモキシフェンを2日間注入する。最後の注射の2〜3日後のラクリマル腺コレクションでは、ピンセットを使用して1つの腺を優しく引っ張ると同時に、小さなはさみの鋭い先端で腺の周りの結合組織を掻いて腺を解放します。
ラクリマル腺と耳下腺が分離されたら、はさみを使用してラクリマル腺を切り取り、氷の上に冷たいPBSを2ミリリットルで35ミリメートル皿に入れます。皿を解剖顕微鏡の下に置き、周囲の脂肪と結合組織をトリミングします。その後、2つの鉗子で涙腺カプセルを取り除きます。
すべての腺が収穫されたら、蛍光顕微鏡で小さな組織を調べて細胞標識を確認します。単一細胞懸濁液を調製するには、ラクリマル腺のすべてを0.5ミリリットルの室温消化媒体を含む35ミリメートル皿に移し、小さなはさみを使用して0.2〜1マイクロメートルの正方形に腺をミンチします。広いボアピペットフィルターチップを使用して、細切り組織を2ミリリットルの丸底チューブに移し、消化媒体でチューブ内の体積を2ミリリットルにします。
チューブを反転させて混合し、1分間に100〜120回転で90分間、37°Cの振動インキュベーターにチューブを入れます。30分ごとに、穴の大きさが減少する1000マイクロリットルフィルターチップを使用して、腺片を20〜30回ゆっくりとトリチュレートします。各トリアージの最後に、クラスターの顕微鏡下で10マイクロリットルのアリコートを検査します。
90分後、サンプルをインスリン注射針を通して2〜3回通過し、細胞をさらに懸濁液に放出し、細胞溶液を15ミリリットルのチューブに移す。ブロッキングミディアムタイプ1を合計5ミリリットルに加え、反転によってチューブを2〜3回混合します。70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに細胞を渡し、ブロッキングミディアムタイプ1の1ミリリットルでストレーナーを洗い、フィルターを通して細胞をもう一度緊張させます。
次に遠心分離により細胞を回収し、ブロッキング媒体タイプ2の2ミリリットルでペレットを再懸濁する。細胞を2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離によって細胞を採取する。アキュターゼ溶液の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、摂氏37度で2〜3分間のインキュベーションを行い、毎分100~120回転します。
インキュベーションの終わりに、細胞を50ミリリットルのチューブに移し、ブロッキング培地タイプ1の最大10ミリリットルを加えます。遠心分離後、室温で30分間培養するために、6ミリリットルの回収培地で細胞を再懸濁する。インキュベーションの最後に、顕微鏡下で10マイクロリットルのサンプルをチェックして、完全な細胞解離を確認します。
カウント後、遠心分離により細胞を採取する。蛍光活性化細胞選別、またはFACSの細胞を染色するには、400マイクロリットルのFACSバッファーを含む2ミリリットルチューブ当たりの5つの細胞に最大5倍の10を加え、ブリリアントバイオレット421アンチマウスCD326と0.5マイクロリットルのゴーストレッド780 Viability Dyeを5マイクロリットル加えます。完全に混合した後、回転で4°Cで45分のインキュベーションのためにホイルでチューブを包みます。
インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収集し、サンプル当たりFACSバッファーの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。細胞サンプルを氷上の個々の5ミリリットルFACSチューブに移し、単一のカラーコントロールを使用して補償を調整します。その後、100マイクロメートルのノズルを通して平方インチあたり20ポンドで細胞をソートします。
微小血管周囲細胞は毛細血管の壁の周りに発達し、正方形の形状を示す。筋上皮細胞は、涙液分泌アキニを取り囲み、長いプロセスを有し、比較的広い領域を占める。ここで、蛍光活性化細胞選別に備えて涙腺から解離した細胞が、ちょうど実証したように、示されている。
筋上皮細胞と近母細胞のフロー細胞量分類では、ダブレットを除外する前に、まず細胞を前方および横散乱領域によってゲートする必要があります。死んだ細胞を除外するために、制御サンプルは、バックグラウンドノイズを決定し、信号間の最適な分離のための適切な補償を確立するために使用されます。プロトコルに記載されているように腺と消化媒体の体積の数を維持し、すべてのステップで組織消化の効率をチェックすることを忘れないでください。
単離された細胞は、インビボ/インビトロ実験、例えば細胞培養、移植、メタボロミクス、プロテオミクス、単一細胞解析を含む複数の下流アプリケーションに使用することができる。
