Este protocolo es significativo porque permite la separación y aislamiento de dos líneas celulares musculares lisas, las células mioepteliales y pericitos. Este método combina el etiquetado genético de las células musculares lisas a través de marcadores de superficie celular para purificar las poblaciones de células mioepteliales y pericitos. Este protocolo permite comparar la función y las capacidades regenerativas de las células mioepteliales sanas y enfermas y procesar estas células para estudios de expresión génica.
Las células mioepteliales existen en otras glándulas exocrinas como el mamífero, el salival y el páncreas, lo que permite adaptar este protocolo mediante el aislamiento de células mioepteliales y pericitos de cualquier otro tejido. Para etiquetar las células que expresan la actina muscular lisa alfa o las células que expresan SMA, inyecte de tres a cuatro semanas de edad tamoxifeno-inducible ratones reporteros con 100 microlitros de tamoxifeno por 20 gramos de peso corporal intraperitonealmente una vez al día durante dos días. Para la recolección de la glándula lacronal, dos o tres días después de la última inyección, use pinzas para tirar suavemente de una glándula mientras al mismo tiempo rasca el tejido conectivo alrededor de la glándula con la punta afilada de un par de tijeras pequeñas para liberar la glándula.
Cuando las glándulas lacronales y parótidas se hayan separado, utilice tijeras para cortar la glándula lacrímica y colocar las glándulas en un plato de 35 milímetros con dos mililitros de PBS frío en hielo. Coloque el plato debajo de un microscopio diseccionado y recorte cualquier grasa circundante y tejido conectivo. A continuación, retire la cápsula de la glándula laringal con dos fórceps.
Cuando todas las glándulas hayan sido cosechadas, revise un pequeño pedazo de tejido bajo un microscopio fluorescente para confirmar el etiquetado celular. Para preparar una suspensión de una sola célula, transfiera todas las glándulas laringales a un plato de 35 milímetros que contenga 0,5 mililitros de medio de digestión a temperatura ambiente y utilice tijeras pequeñas para picar las glándulas en trozos cuadrados de 0,2 a un micrómetro. Usando una punta de filtro de pipeta de diámetro ancho transfiera el tejido picado en un tubo de dos mililitros de fondo redondo y lleve el volumen en el tubo a dos mililitros con medio de digestión.
Invierta el tubo para mezclar y coloque el tubo en una incubadora de agitación de 37 grados centígrados durante 90 minutos a 100 a 120 rotaciones por minuto. Cada 30 minutos tritura lentamente las piezas de la glándula de 20 a 30 veces usando 1000 puntas de filtro de microlitro con un tamaño de agujero decreciente. Al final de cada trituración, inspeccione una alícuota de 10 microlitros bajo un microscopio en busca de racimos.
Después de 90 minutos, pase la muestra dos o tres veces a través de una aguja de jeringa de insulina para liberar aún más las células en suspensión y transferir la solución celular a un tubo de 15 mililitros. Añadir el medio de bloqueo tipo 1 a un total de cinco mililitros y mezclar el tubo de dos a tres veces por inversión. Pasar las células a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros, y lavar el colador con un mililitro de bloqueo medio tipo 1, antes de forzar las células a través del filtro una vez más.
A continuación, recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en dos mililitros de bloqueo medio de bloqueo tipo 2. Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y recoja las células por centrifugación. Resuspender las células en un mililitro de solución Accutase para una incubación de dos a tres minutos a 37 grados centígrados y 100 a 120 rotaciones por minuto.
Al final de la incubación, transfiera las células a un tubo de 50 mililitros y agregue hasta 10 mililitros de medio de bloqueo tipo 1. Después de la centrifugación resuspender las células en seis mililitros de medio de recuperación para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, revise una muestra de 10 microlitros bajo el microscopio para asegurar la disociación completa de las células.
Después de contar, recoger las células por centrifugación. Para manchar las celdas para la clasificación celular activada por fluorescencia, o FACS, agregue hasta cinco veces 10 a las cinco células por cada tubo de mililitro que contiene 400 microlitros de tampón FACS y agregue cinco microlitros de Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 y 0.5 microlitros de Ghost Red 780 Viability Dye. Después de una mezcla a fondo, envuelva los tubos con papel de aluminio para una incubación de 45 minutos a 4 grados centígrados con rotación.
Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y resuspend los pellets en un mililitro de tampón FACS por muestra. Transfiera las muestras de celda a tubos individuales de cinco mililitros FACS sobre hielo y ajuste la compensación mediante controles de un solo color. Luego ordene las células a 20 libras por pulgada cuadrada a través de una boquilla de 100 micrómetros.
Los per pericitos microvasculares se desarrollan alrededor de las paredes de los capilares y demuestran una forma cuadrada. Las células mioepithelial rodean el acini secretor lacrímal, tienen procesos largos y ocupan un área relativamente grande. Aquí, se muestran las células disociadas de una glándula lacronal en preparación para la clasificación celular activada por fluorescencia, como se acaba de demostrar.
Para la clasificación citométrica de flujo de células mioepteliales y pericitos, las células deben ser cerradas primero por sus áreas de dispersión lateral y delantera antes de excluir cualquier doblete. Después de gating para excluir las células muertas, se utilizan muestras de control para determinar el ruido de fondo y para establecer una compensación adecuada para una separación óptima entre las señales. Recuerde mantener el número de glándulas y el volumen medio de digestión como se describe en el protocolo, y para comprobar la eficiencia de la digestión de los tejidos en todos los pasos.
Las células aisladas se pueden utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, incluidos experimentos in vivo/in vitro, por ejemplo cultivo celular, trasplante, metabolómica, proteómica y análisis de una sola célula.
