هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بفصل وعزل اثنين من خطوط خلايا العضلات الملساء ، والخلايا العضلية و pericytes. هذه الطريقة تجمع بين العلامات الجينية للخلايا العضلية الملساء عبر علامات سطح الخلية لتنقية مجموعات من الخلايا العضلية والخلايا. يسمح هذا البروتوكول مقارنة وظيفة وقدرات التجدد من الخلايا المياة والمُرَضَّة المعالجة هذه الخلايا لدراسات التعبير الجيني.
توجد الخلايا اللمية في الغدد الطاردة الأخرى مثل الغدد الثديية، اللعابية، والبنكرياس، والتي تسمح هذا البروتوكول أن تتكيف من خلال عزل الخلايا الخراجية والخلايا من أي أنسجة أخرى. لتسمية ألفا العضلات الملساء actin أو SMA التعبير عن الخلايا, حقن ثلاثة إلى أربعة أسابيع تاموكسيفين-inducible ألفا SMA مدفوعة الفئران مراسل مع 100 ميكرولترات من تاموكسيفين لكل 20 غراما من وزن الجسم intraperitoneally مرة واحدة في اليوم لمدة يومين. لجمع الغدة اللاكرية، بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحقن الأخير، استخدم ملاقط لسحب غدة واحدة بلطف وفي الوقت نفسه خدش النسيج الضام حول الغدة مع طرف حاد من زوج من مقص صغير لتحرير الغدة.
عندما تم فصل الغدد اللاكريمال و parotid، استخدم مقص لقطع الغدة اللاكريل ووضع الغدد في طبق 35 ملليمتر مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد. ضع الطبق تحت مجهر تشريح وتقليم أي الدهون المحيطة والأنسجة الضامة. ثم إزالة كبسولة الغدة اللاكرية مع اثنين من ملقط.
عندما يتم حصاد جميع الغدد، تحقق من قطعة صغيرة من الأنسجة تحت المجهر الفلوري لتأكيد وضع العلامات على الخلايا. لإعداد تعليق من خلية واحدة، نقل جميع الغدد اللاكريمال إلى طبق 35 ملليمتر يحتوي على 0.5 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة الهضم المتوسطة واستخدام مقص صغير لفرم الغدد إلى 0.2 إلى قطعة مربعة ميكرومتر واحد. باستخدام طرف مرشح ماصات كبير واسع ينقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب دائري القاع بمليلتر ويجلب الصوت في الأنبوب إلى ملليلترين مع متوسط الهضم.
عكس أنبوب لخلط، ووضع أنبوب في حاضنة اهتزاز درجة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 100 إلى 120 التناوب في الدقيقة الواحدة. كل 30 دقيقة تُجرّد قطع الغدة ببطء 20 إلى 30 مرة باستخدام نصائح 1000 ميكرولتر للتصفية مع انخفاض حجم البير. في نهاية كل التثايف، تفقد 10 ميكرولتر aliquot تحت المجهر لمجموعات.
بعد 90 دقيقة تمرير العينة مرتين إلى ثلاث مرات من خلال حقنة حقنة الأنسولين إلى مزيد من الإفراج عن الخلايا في تعليق ونقل حل الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. إضافة كتلة متوسطة النوع 1 إلى ما مجموعه خمسة ملليلتر وخلط الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق الانقلاب. مرر الخلايا من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر، وغسل المصفاة بميليلتر واحد من حظر النوع المتوسط 1، قبل إجهاد الخلايا من خلال الفلتر مرة أخرى.
المقبل جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من حظر حظر النوع المتوسط 2. نقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسنتروج ميليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من حل Accutase لحضانة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية و 100 إلى 120 التناوب في الدقيقة الواحدة.
في نهاية الحضانة، نقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر وإضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من حظر النوع المتوسط 1. بعد الطرد المركزي إعادة تعليق الخلايا في ستة ملليلتر من الانتعاش المتوسطة لاحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، تحقق من عينة 10 ميكرولتر تحت المجهر لضمان انفصام الخلايا كاملة.
بعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. لطخة الخلايا لفرز الخلايا التي تعمل بالفلوريسين، أو FACS، تضيف ما يصل إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل أنبوب ملليلتر تحتوي على 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS وإضافة خمسة ميكرولترات من العبقرية البنفسجية 421 المضادة الماوس CD326 و 0.5 ميكرولترات من شبح الأحمر 780 صبغة البقاء. بعد خلط شامل، التفاف الأنابيب مع احباط لاحتضان 45 دقيقة في 4 درجة مئوية مع التناوب.
في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من عازلة FACS لكل عينة. نقل عينات الخلية إلى أنابيب FACS 5 ملليلتر فردية على الجليد وضبط التعويض باستخدام عناصر تحكم لون واحد. ثم فرز الخلايا في 20 جنيه لكل بوصة مربعة من خلال فوهة ميكرومتر 100.
تتطور البيريثية الدقيقة حول جدران الشعيرات الدموية وتبرهن على شكل مربع. الخلايا ميو فيتهيليال تحيط acini إفرازية lacrymal, لديها عمليات طويلة, وتحتل مساحة كبيرة نسبيا. هنا، تظهر الخلايا المنفصلة عن الغدة اللاكرمالية استعدادا لفرز الخلايا التي تعمل بالفلوريسين، كما هو مبين للتو.
بالنسبة للفرز السيتومي للتدفق من الخلايا الميوفية و pericytes يجب أن تكون الخلايا أولاً مسورة من قبل مناطقها الأمامية و الجانب المبعثرة قبل استبعاد أي مزدوجة. بعد الغاء لاستبعاد الخلايا الميتة، وتستخدم عينات التحكم لتحديد الضوضاء الخلفية وتحديد التعويض المناسب لفصل الأمثل بين الإشارات. تذكر أن تحافظ على عدد الغدد والهضم الحجم المتوسط كما هو موضح في البروتوكول ، والتحقق من كفاءة هضم الأنسجة في جميع الخطوات.
يمكن استخدام الخلايا المعزولة للتطبيقات المصب متعددة بما في ذلك في التجارب في الجسم الحي / في المختبر ، على سبيل المثال زراعة الخلية ، وزرع ، والميدومينوميات ، والبروتيوميات ، وتحليل خلية واحدة.
