斑马鱼正在成为研究美因病染色体事件的优秀脊椎动物模型，包括同源染色体配对、突触和重组。这种核表面扩散协议使我们能够使用超分辨率显微镜来可视化美的染色体结构的关键特征。研究人员预计，与其他斑马鱼传播协议一样，每张幻灯片上有数百个分布良好的核，碎片更少。
这个程序最具技术挑战性的部分是解剖斑马鱼睾丸，因为它靠近皮肤，也连接到其他器官。可视化解剖程序将使研究人员知道当看到嵌入在动物组织中的性腺时会发生什么。对雄性斑马鱼进行安乐死后，用小剪刀一次斩首一条鱼，然后用微型剪刀沿着腹中线切割，露出体腔。
将鱼放在硅胶涂层的培养皿中，并覆盖在1X PBS的浅池中。在1.65倍放大的显微镜下，使用钳子解剖睾丸。从睾丸中去除尽可能多的脂肪和周围组织。
性腺在解剖范围光下会半透明，而周围的脂肪可能略暗。在不妨碍程序的情况下，一定数量的脂肪可能留在性腺上。将每个解剖的睾丸直接加入一个五毫升的管中，并加入两毫升的DMEM，并留在冰上。
为了分离睾丸细胞，将200微升的胶原酶溶液加入五毫升管中。通过反转解决方案多次混合解决方案。在 32 摄氏度的 100 RPM 下，以 100 RPM 水平摇动孵化器摇床中的睾丸。
每10分钟快速反转一次管子，以方便分离。一小时后，DMEM 多云，睾丸成小块。当睾丸在胶原酶中孵育时，预热100微升0.1摩尔蔗糖溶液至37摄氏度。
要洗掉胶原酶，将DMEM加入五毫升的最终体积，并反转管子几次。在室温下，在200克下将睾丸取出3分钟。取出三毫升的上一液，使只保留两毫升。
重复 DMEM 洗涤两次。上次 DMEM 洗涤后，取出四毫升的上经剂，并添加 1 毫升 DMEM、200 微升的 trypsin 溶液和 20 微升的 DNase I 溶液。反转管子几次以混合溶液。
在 100 RPM 时，在 32 摄氏度下水平摇动管。每五分钟快速反转一次管子，以方便分离。5 到 15 分钟后，DMEM 解决方案仅包含几团。
加入500微升的尝试性抑制剂溶液和50微升的DNase I溶液。反转管子几次混合，然后在室温下以 200 g 短暂旋转三分钟，以去除可能粘附在管盖或管侧的液体或团块。将管子放在冰上，用塑料转移移液器反复上下移液，以方便分离任何剩余的团块，从而重新悬浮细胞悬浮液。
确保电池悬架不会进入转移移液器的灯泡。然后用DMEM预湿100微米细胞过滤器，并放在50毫升的冰管上。使用塑料转移移液器一次通过过滤器一滴转移细胞悬浮液。
使用塑料移液器将滤液转移到新的五毫升管中。请务必收集连接到过滤器底面的池单元格。将DMEM加入管子，最终体积为5毫升。
在室温下，在200克下将细胞取出5分钟。在不干扰颗粒的情况下，尽可能去除上一除更远，并将五升DNase I溶液直接加入到颗粒中。然后，通过沿着空的微离心管机架轻轻刮四到五次管外底，将颗粒与 DNase I 溶液混合。
将 DMEM 添加到五毫升的最终体积中，通过多次反转管子混合溶液。在室温下，以200克对细胞悬浮液进行两分钟。重复DNase处理一到三次，直到重新消耗的颗粒在加入DMEM后不会团块。
最后一次旋转后，尽可能去除上一除，而不会干扰颗粒。接下来，加入1X PBS的毫升，然后沿着空管架轻轻刮取管子的外底，重新暂停颗粒。在200g下将细胞悬浮液在5分钟内，然后在不干扰颗粒的情况下去除尽可能多的上一液。
从 200 微升移液器尖端的末端切割 3 毫米，以扩大孔径。使用切割移液器尖端，通过上下移液，将颗粒重新在 0.1 摩尔蔗糖溶液的 80 微升中重新入库。让电池悬浮液在室温下坐三分钟。
接下来，用移液器尖端，用 100 微升 1%甲醛涂覆一张幻灯片，用 0.15% Triton X-100 涂上一张幻灯片。然后，以垂直于长边直线将 18 微升的蔗糖悬浮液添加到幻灯片的中心。来回倾斜幻灯片，以方便将细胞悬浮液扩散到所有角落。
将滑梯平放在稍微裂开的打开的湿度室中，以防止甲醛溶液干燥。将湿度室放在黑暗的抽屉中过夜。早晨，从湿度室取下盖子，让滑梯完全干燥。
将幻灯片放在一个科普林罐中，然后用蒸馏水填充科普林罐。在室温下轻轻摇晃，孵育五分钟。倒出水，用1至250个润湿剂填满罐子。
在室温下轻轻摇晃，每次洗涤两次，每次五分钟。让幻灯片完全干燥并储存在零下 20 摄氏度，直到它们被染色。该协议概述了一种准备和可视化斑马鱼精子细胞传播的方法，该方法产生分布良好的非重叠核。
左侧的面板显示了三个阶段的梅蒂克前体，钩端，早期的青霉素，和帕奇滕。每个阶段都用端粒染色品红色。此处显示了由于 DNase I 治疗不足而导致质量差的点差示例。
为SYCP3染色的美的染色体表明，由于粘性蔗糖细胞悬浮液，阻止细胞在幻灯片上正确扩散，核重叠。从正确的起始材料量开始，在三叶草中治疗斑马鱼睾丸的时间适当，并进行必要数量的DNase I治疗是非常重要的，因为不这样做会导致很少的核或块核。使用甲醛时，应始终佩戴适当的 PPE。
遵循扩散过程，染色体可以染色，以可视化各种染色体结构，以及双链断裂，以分析时间依赖和定位的美的事件。我们的技术为表明斑马鱼可能是人类精子生成更好的模型铺平了道路，因为根据染色体特征和端粒花束，斑马鱼可能是人类精子生成更好的模型。
