筛选精子以快速分离斑马鱼的种系编辑

该协议描述了一种使用F0 CRISPR注射的斑马鱼精子快速筛选数千个基因组的方法。这种技术在其可访问性方面是有利的。我们的方法不是昂贵的、专门的基于测序的方法，而是使用PCR限制性内切酶和凝胶电泳来筛选F0男性携带者以进行插入缺失或特异性基因组编辑。

这个过程最困难的部分是快速获得精子，但如果我们与大量畸形鱼一起工作，它将成为体外受精的好技术，因此这是我们杂交给我们带来麻烦的鱼的简单方法。首先为野生型和F0鱼设置繁殖池，并在夜间孵化水箱。第二天麻醉雄鱼后，用漏勺将其转移到一堆干净的纸巾上。

轻轻滚动鱼以去除多余的水分。用干净的折叠纸巾吸干水分，以去除任何水分。使用漏勺将鱼转移到准备好的海绵上。

将鱼的腹侧朝上，用干净的折叠薄纸轻轻吸干臀鳍周围的区域。要收集精子，请使用毛细管轻轻地将盆鳍从中线移开，露出泄殖腔。将毛细管放在泄殖腔附近。

用手指或一对过滤镊，从鳃向下轻轻挤压鱼的侧面。使用毛细管作用，将精子收集在管中并将其放入含有40微升50毫摩尔氢氧化钠溶液的PCR管中，然后将样品排出到管中。在小型离心机中旋转精子样品后，将PCR管放入热循环仪中。

通过在95摄氏度下加热样品40分钟，然后在25摄氏度下冷却来运行循环仪。从循环仪中取出样品后，加入10微升pH为8的1摩尔三盐酸盐来中和pH值。通过吸出悬浮液进行混合，然后离心样品。

将热循环仪设置为 95 摄氏度以进行预热。同时，为每个精子样品准备25微升PCR反应混合物。通过上下移液充分混合，然后旋转样品。

将样品放入预热的热循环仪中并设置循环。为了获得凝胶溶液，通过微波加热通过混合琼脂糖粉，凝胶染色剂和TBE缓冲液制备的4%琼脂糖凝胶溶液。将凝胶溶液倒入凝胶浇铸框架中，并在一侧插入梳子。

凝胶凝固后，小心地取下梳子。将凝胶放入电泳台中，使孔最靠近负极。将TBE运行缓冲液倒入钻机中，直到孔完全浸没。

通过将五微升DNA分子量标准移液到第一个孔中开始加载凝胶。用5至10微升PCR产物加载剩余的孔。在 150 伏下运行凝胶 1 小时，以确保扩增子充分分离。

使用凝胶成像仪查看DNA条带。P2ry12基因座分析显示，野生型扩增子显示250个碱基对长度的单条带，而含有插入缺失的F0注入雄性扩增子以多个条带的形式运行。DNAH10位点分析表明，野生型扩增子以单个400碱基对长带的形式运行。

含有插入缺失的F0注射雄性扩增子以多条带或单个条带的形式运行，凝胶迁移率降低。F0注射的男性一号在消化产物中有一个额外的条带，该条带在PCR产物中不存在，使其成为突变敲入线建立的最佳创始人候选者。如果雄鱼在挤压时不产生精子，最好让鱼休息一周，然后再试一次，而不是用力挤压它们并冒着伤害它们的风险。

一旦FC或男性创始人被杂交，就需要在F1后代中对等位基因进行序列验证。直接对F1扩增子进行测序并进行杂合等位基因分析是一种简单的方法。