Зебрафиш становится отличной позвоночной моделью для изучения хромосомных событий мейоза, включая гомологичные хромосомные спаривания, синапсис и рекомбинацию. Этот протокол распространения ядерной поверхности позволил нам визуализировать ключевые особенности архитектуры мейотической хромосомы с помощью микроскопии супер разрешения. Исследователи могут ожидать сотни хорошо распространяемых ядер на слайд с меньшим количеством мусора, чем другие протоколы распространения зебры.
Наиболее технически сложной частью этой процедуры является вскрытие яиц зебры, так как она находится в непосредственной близости от кожи, а также прилагается к другим органам. Визуализация процедуры вскрытия позволит исследователям знать, чего ожидать, когда они видят гонад, встроенный в ткани животного. После усыпляния самца зебры, обезглавить одну рыбу в то время, с маленькими ножницами, а затем использовать микро ножницы, чтобы сократить вдоль брюшной средней линии подвергать полости тела.
Поместите рыбу в силиконовую чашку Петри и накройте мелководным бассейном 1X PBS. Под микроскопом при увеличении 1.65X, рассекают яички с помощью типсов. Удалите как можно больше жира и окружающих тканей из яитесов, как это возможно.
Гонад будет казаться полупрозрачным под светом области вскрытия, в то время как окружающий жир может иметь немного более темный вид. Некоторое количество жира может быть оставлено на гонаде, не посягов процедуре. Добавляйте каждый вскрытый яички прямо в пятими миллилитровую трубку с двумя миллилитров DMEM и держите на льду.
Чтобы разобщить клетки яиц, добавьте 200 микролитров раствора коллагеназы в пятими миллилитровую трубку с яичками. Смешайте раствор, инвертировать его несколько раз. Аккуратно встряхните яички в инкубаторе шейкер горизонтально при 100 об/мин при 32 градусах по Цельсию.
Быстро инвертировать трубку каждые 10 минут, чтобы облегчить диссоциацию. Через час, DMEM облачно и яички в небольших кусках. В то время как яички инкубируется в коллагеназе, довоенные 100 микролитров раствора молярной сахарозы до 37 градусов по Цельсию.
Чтобы вымыть коллагеназу, добавьте DMEM в окончательный объем в пять миллилитров и инвертировать трубку несколько раз. Пеллет яички на 200 г в течение трех минут при комнатной температуре. Удалите три миллилитров супернатанта, чтобы остались только два миллилитров.
Повторите DMEM мыть два дополнительных раза. После последней стирки DMEM удалите четыре миллилитров супернатанта и добавьте один миллилитр DMEM, 200 микролитров трипсиного раствора и 20 микролитров раствора DNase I. Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать раствор.
Горизонтально встряхните трубку при 32 градусах цельсия при 100 об/мин. Быстро инвертировать трубку каждые пять минут, чтобы облегчить диссоциацию. Через 5-15 минут решение DMEM содержит лишь несколько комков.
Добавьте 500 микролитров раствора ингибитора трипсина и 50 микролитров раствора DNase I. Инвертировать трубку несколько раз, чтобы смешать затем кратко спина вниз на 200 г в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость или сгустки, которые могут придерживаться трубки крышки или стороны трубки. Поместите трубку на лед и resuspend клеточной подвески, неоднократно трубопроводов вверх и вниз с пластиковой пипетки передачи в течение двух минут, чтобы облегчить диссоциацию любых оставшихся сгустков.
Убедитесь, что подвеска ячейки не попадает в лампу переаттоки. Затем предварительно влажный 100 микрон-клеточный ситечко с DMEM и поместите его на вершине 50 миллилитров трубки на льду. Передача подвески клетки через ситечко по одной капле за один раз с помощью пластиковой трубы передачи.
Перенесите фильтрат с помощью пластиковой трубы передачи в новую пятими миллилитровую трубку. Обязательно соберите соединенные ячейки, прикрепленные к нижней стороне фильтра. Добавьте DMEM в трубку до конечного объема в пять миллилитров.
Пеллет клетки при 200 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы и добавить пять микролитров раствора DNase I непосредственно в гранулы. Затем смешайте гранулы с раствором DNase I, аккуратно соскоб внешней нижней части трубки четыре-пять раз вдоль пустой стойки трубки микроцентрифуг.
Добавьте DMEM к окончательному объему в пять миллилитров и смешайте раствор, инвертировать трубку несколько раз. Пеллет клеточной подвески при температуре 200 г в течение двух минут при комнатной температуре. Повторите лечение DNase дополнительно один-три раза, пока перерасход гранулы не слипаются при добавлении DMEM.
После последнего спина, удалить столько, сколько супернатант, как это возможно, не нарушая гранулы. Затем добавьте один миллилитр 1X PBS и повторно посовещайте гранулы, аккуратно соскаблив внешнюю нижнюю часть трубки вдоль пустой трубчатой стойки. Пеллет клеточной подвески на 200 г в течение пяти минут, а затем удалить как можно больше супернатантов, как это возможно, не нарушая гранулы.
Вырезать три миллиметра от конца 200 микролитров пипетки кончик расширить диафрагму. С разрезом наконечник пипетки, повторно гранулы в 80 микролитров 0,1 молярной сахарозы раствора путем трубопроводов вверх и вниз. Пусть подвеска клетки сидеть при комнатной температуре в течение трех минут.
Далее, с наконечником пипетки, пальто один слайд со 100 микролитров 1%формальдегида с 0,15%Triton X-100. Затем добавьте 18 микролитров подвески клетки сахарозы на центр слайда по прямой линии перпендикулярно длинной кромке. Наклоните слайд вперед и назад, чтобы облегчить распространение подвески ячейки на все углы.
Поместите горки плоскими вниз в слегка трещины открытой камеры влажности, чтобы предотвратить формальдегид раствор от высыхания. Поместите камеру влажности в темный ящик на ночь. Утром снимите крышку с камеры влажности и дайте слайдам полностью высохнуть.
Поместите слайды в банку coplin, а затем заполнить копин банку с дистиллированной водой. Инкубировать в течение пяти минут с нежной тряской при комнатной температуре. Вылейте воду и заполнить банку с 1 до 250 смачивания агента.
Вымойте два раза в течение пяти минут каждый с нежной тряски при комнатной температуре. Разрешить слайды полностью высохнуть и хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пока они не окрашены. В этом протоколе изложен метод подготовки и визуализации распространения сперматозоидов-зебрафиш, который дает хорошо распространяющиеся некрывающиеся ядра.
Панели слева показывают три стадии мейотической профазы, лептотена, раннего зиготена и пахитена. Теломеры были окрашены пурпурный для каждого этапа. Пример низкого качества распространяется из-за недостаточного лечения DNase I показаны здесь.
Мейотические хромосомы, окрашенные для SYCP3, указывают на перекрывающиеся ядра из-за вязкой подвески клеток сахарозы, которая предотвращает правильное распространение клеток на слайде. Очень важно начать с правильного количества исходного материала, лечить тесты зебры в течение соответствующего количества времени в трипсине, и выполнять необходимое количество DNase I лечения, как неспособность сделать это может привести к очень мало ядер или слипшиеся ядра. Правильный СИЗ всегда следует носить при работе с формальдегидом.
После процедуры распространения хромосомы могут быть окрашены для визуализации различных хромосомных структур, а также двухтяговые разрывы для анализа зависимости от времени и локализации мейотических событий. Наша техника проложила путь для того, чтобы показать, что зебрафиш может быть лучшей моделью человеческого сперматогенеза, чем мышь на основе особенностей хромосомы и букета теломер.
