果蝇黑色素的循环训练

同步果蝇定义昼夜时间是研究控制或响应生物钟的事件的第一步。所有模型的同步将遵循相同的基本方法。有许多步骤，以做到这一实际，它可能似乎压倒性地把它们放在一起。

期待尝试几次之前，感觉自然。保持温度稳定，我希望在三分钟的步骤中把灯亮掉。在121摄氏度的Crock-Pot中准备飞食，加入配料混合。

盖上锅盖，将内装物煮沸，每10分钟混合一次。20分钟后，在滚动煮沸，关闭热量，并添加83.6毫升的水到克罗克锅。当食物冷却时，请把盖子盖掉。

当食物冷却时，每10分钟搅拌一次，以免在顶部形成薄膜。还要用玻璃温度计每 10 分钟测量一次温度。一旦食物冷却到60摄氏度以下，加入特格塞普特和丙维酸，如手稿中所述。

混合好，调整Crock-Pot，以保持温度，只是几度低于60摄氏度。使用近体泵分配飞食。对于狭窄的小瓶，泵 10 毫升，对于 6 盎司方形底部瓶，泵 60 毫升。

在25摄氏度下储存野生苍蝇10至12天，直到约200只幼蝇附着在瓶子的内侧。要将成人从瓶子中取出，请将成人放入新瓶子中，并使用数字零画笔的钝端将剩余的成人推入。使用前和使用后用 70% 乙醇擦拭画笔。

在25摄氏度下孵育幼崽，让下一代出现。三天后，苍蝇将零到三天大。请记住，温度、光线，甚至您选择的食物都会影响训练。

在实验过程中，请务必保留每个控件。在指定的采集时间点，使用二氧化碳麻醉垫固定苍蝇，并收集100名男性和100名女性。雌性苍蝇比雄蝇大得多。

苍蝇也可以通过检查生殖器来区分。男性有深色圆润的生殖器，而女性有更轻，更尖的生殖器。将男性和女性放在单独的小瓶中，每瓶有100只雌性，每瓶有50只雌性。

当小瓶中有100个人时，男性的社会交往导致许多死亡。为了使昼夜感染发生，将小瓶放在受光调节的培养箱中三到五天。为了将来生产苍蝇，把剩下的雌性中的25只，剩下的5到7只放在一个新瓶子里。

在25摄氏度下孵育瓶子。每收集100只苍蝇。通过添加4.8毫升的固定剂来准备一个狭窄的小瓶。

将狭窄的小瓶放在一桶冰中，将桶、纸巾、铝箔和胶带放在孵化器中。要收集苍蝇，请将漏斗放在狭窄的小瓶中，然后从苍蝇小瓶中取下瓶盖，并迅速将其反转到漏斗中。轻轻点击，帮助引导苍蝇进入固定瓶。

收集雄性时，将两个50只苍蝇的小瓶组合成一个狭窄的小瓶。将 ZT13 和 ZT19 小瓶包裹在铝箔中。转移苍蝇后，将瓶盖固定到位，以避免溢出。

将小瓶以 165 RPM 和 4 摄氏度的速度放在 Nutating 混合器上，持续 4 小时。苍蝇不再对光敏感，因此，箔可以去除，以验证苍蝇是否被淹没在固定器中。从坚果混合器中去除小瓶后，去除甲醛，然后用 3000 微升 1X PBS 洗涤苍蝇三次，每次洗涤时将小瓶反转。

将小瓶存放在摄氏四度，等待未来的免疫荧光。光和黑暗被用来将苍蝇包裹到昼夜循环。通过免疫印迹和周期蛋白的免疫荧光分析验证了约束，该期蛋白是昼夜结合的标记。

从被训练苍蝇头部准备的整细胞提取物的免疫印迹显示了一个时期蛋白质流动性和强度的规范模式。在ZT1收集的被约束大脑的免疫荧光显示了具有特征的模式的时期蛋白。此方法是免疫荧光、免疫分配、免疫沉淀、行为分析以及您可能想要使用的任何其他技术的起点，用于比较通路随生物钟滴答作响时的变化。

通过训练模型生物体的能力，你可以问你最喜欢的路径是否随时间而变化，以及你最喜欢的通路的影响是否会导致生物的中断。生物钟被破坏时，许多疾病会恶化。确定基本机制将有助于我们为患有阿尔茨海默氏症和帕金森病等疾病的人创造更有效的药物。