Sincronizar Drosophila para definir tiempos circadianos es el primer paso en el estudio de eventos que controlan o responden al reloj biológico. La sincronización de todos los modelos seguirá el mismo enfoque básico. Hay muchos pasos para hacer esto práctico y puede parecer abrumador ponerlos todos juntos.
Espere probar un par de veces antes de que se sienta natural. Mantenga las temperaturas estables y quiero que la luz se ate durante los pasos de tres minutos. Preparar los alimentos mosca en un Crock-Pot a 121 grados Celsius, mezclando a medida que se añaden ingredientes.
Cubrir el Crock-Pot y llevar el contenido a una ebullición rodante, mezclando el contenido cada 10 minutos. Después de 20 minutos en una ebullición rodante, apague el fuego y agregue 83,6 mililitros de agua al Crock-Pot. Deje la tapa mientras la comida se enfría.
Mientras la comida se enfría, revuelva cada 10 minutos para evitar permitir que se forme una película en la parte superior. También mida la temperatura cada 10 minutos con un termómetro de vidrio. Una vez que el alimento se haya enfriado a menos de 60 grados centígrados, agregue Tegosept y ácido propiónico, como se describe en el manuscrito.
Mezcla bien y ajusta el Crock-Pot para mantener una temperatura, sólo unos pocos grados menos de 60 grados Celsius. Utilice una bomba peristáltica para distribuir los alimentos para moscas. Para viales estrechos, bombee 10 mililitros, y para botellas inferiores cuadradas de seis onzas, bombee 60 mililitros.
Almacene las moscas de tipo salvaje a 25 grados centígrados durante 10 a 12 días, hasta que aproximadamente 200 pupas se adhieran al interior de la botella. Para retirar a los adultos de la botella, encóqueles en una botella nueva y use el extremo opaco de un pincel número cero para empujar a los adultos restantes. Limpie el pincel con 70%etanol antes y después de su uso.
Incubar las pupas a 25 grados centígrados para permitir que la próxima generación surja. Después de tres días, las moscas tendrán de cero a tres días. Recuerde que la temperatura, la luz e incluso su elección de alimentos influirán en el arrastre.
Asegúrese de mantenerlos, cada control durante el experimento. En los puntos de tiempo designados para la recolección, utilice una almohadilla de anestesia de dióxido de carbono para inmovilizar a las moscas, y recoger 100 machos y 100 hembras. Las moscas hembra son mucho más grandes que los machos.
Las moscas también se pueden diferenciar examinando los genitales. Los machos tienen genitales redondeados oscuros, mientras que las hembras tienen genitales más claros y puntiagudos. Coloque a los machos y a las hembras en viales separados con 100 hembras por vial y 50 machos por vial.
Las interacciones sociales masculinas conducen a muchas muertes cuando hay 100 individuos en un vial. Para permitir que se produzca el arrastreo circadiano, coloque los viales en incubadoras reguladas por luz durante tres a cinco días. Para producir moscas para el futuro entrenamiento, coloque 25 de las hembras restantes, y de cinco a siete de los machos restantes en una botella nueva.
Incubar la botella a 25 grados centígrados. Por cada 100 moscas que serán recogidas. Preparar un vial estrecho añadiendo 4,8 mililitros de fijador.
Coloque los viales estrechos en un cubo de hielo y lleve el cubo, las toallas de papel, el papel de aluminio y la cinta adhesiva a la incubadora. Para recoger las moscas, coloque un embudo en el vial estrecho, luego retire la tapa del vial de moscas e invierta rápidamente en el embudo. Toque suavemente para ayudar a guiar a las moscas hacia el vial de fijación.
Al recoger machos, combine dos viales de 50 moscas en un vial estrecho. Envuelva los viales para ZT13 y ZT19 en papel de aluminio. Después de transferir las moscas, pegue las tapas en su lugar para evitar derrames.
Coloque los viales en el mezclador Nutating a 165 RPM y cuatro grados centígrados durante cuatro horas. Las moscas ya no son sensibles a la luz, por lo que, la lámina puede ser removida para verificar que las moscas están siendo sumergidas en el fijador. Después de retirar los viales del mezclador de enclavamiento, retire el formaldehído y, a continuación, lave las moscas tres veces con 3000 microlitros de 1X PBS, invirtiendo el vial durante cada lavado.
Almacene los viales en cuatro grados centígrados, para esperar la inmunofluorescencia futura. La luz y la oscuridad se utilizaron para entrenar moscas a los ciclos circadianos. El entrenamiento se verificó mediante inmunoblotting, y el análisis de inmunofluorescencia de la proteína del período, un marcador para el entrenamiento circadiano.
La inmunoblotting de extractos de células enteras, preparadas a partir de cabezas de moscas entrenadas muestra un patrón canónico de movilidad e intensidad de proteínas de época. La inmunofluorescencia de cerebros atrapados, recogida en ZT1, muestra proteínas de época en el patrón característico. Este método es un punto de partida para inmunofluorescentes, inmunoplotting, inmunoprecipitación, análisis conductual y cualquier otra técnica que desee utilizar para comparar cómo cambia la vía a medida que el reloj biológico garrapatas.
Con la capacidad de entrenar a su organismo modelo, puede preguntar si su vía favorita cambia con el tiempo, y si los efectos en su vía favorita pueden conducir a la interrupción de lo biológico. Una serie de enfermedades empeoran cuando se interrumpe el reloj biológico. Identificar los mecanismos subyacentes nos ayudará a crear medicamentos más eficaces para las personas que sufren de enfermedades, como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
