ショウジョウバエを同期して概日時間を定義することは、生物学的時計を制御または応答するイベントを研究する最初のステップです。すべてのモデルの同期は、同じ基本的なアプローチに従います。これを実用的に行うための多くのステップがあり、それらをすべてまとめるのは圧倒的に思えるかもしれません。
自然に感じる前に数回試してみるのを期待してください。温度を安定させ、3分間の間に明かりを消したい。食材を加えると混ぜて、摂氏121度のクロックポットでフライフードを準備します。
クロックポットを覆い、内容物を10分ごとに混ぜて沸騰させます。20分後に沸騰し、火を消し、83.6ミリリットルの水をクロックポットに加えます。食べ物が冷えるにつれて蓋をはずしたままにしておきます。
食品が冷却されている間、フィルムが上に形成されないように10分ごとにかき混ぜます。また、ガラス温度計で10分ごとに温度を測定します。食品が摂氏60度以下に冷却されたら、原稿に記載されているようにテゴセプトとプロピオン酸を加えます。
よく混ぜて、60°C未満の温度を維持するためにクロックポットを調整します。フライ食品を配布するために蠕動ポンプを使用してください。狭いバイアルの場合、10ミリリットルをポンプし、6オンスの正方形の底のボトルのために、60ミリリットルをポンプ。
野生型ハエは10〜12日間摂氏25度で保管し、約200頭の子犬がボトルの内側に取り付けられるまで保管してください。ボトルから大人を取り除くために、新しいボトルにチップを入れ、残りの大人を押し込むためにナンバーゼロのペイントブラシの鈍い端を使用します。使用前と使用後に70%エタノールでペイントブラシを拭きます。
次の世代が出現できるように、摂氏25度で子犬をインキュベートします。3日後、ハエは生後0日から3日になります。温度、光、そして食べ物の選択さえも、入り込みに影響を与えることを覚えておいてください。
実験中は、各コントロールを保持してください。採取の指定された時点で、二酸化炭素麻酔パッドを使用してハエを固定し、100人の男性と100人のメスを集めます。雌のハエはオスよりはるかに大きい。
ハエはまた生殖器を調べることによって区別することができる。男性は暗い丸みを帯びた生殖器を持っていますが、女性は軽く、より尖った生殖器を持っています。男性と女性をバイアルあたり100人の女性とバイアルあたり50人の男性と別々のバイアルに入れる。
男性の社会的相互作用は、バイアルに100人の個体があるとき、多くの死につながります。概日の巻き込みが起こるようにするために、バイアルを光調節インキュベーターに3〜5日間置きます。将来の入り込みのためにハエを生産するには、残りのメスの25人と残りのオスの5〜7人を新しいボトルに入れます。
ボトルを摂氏25度でインキュベートします。収集される100ハエごとに。固定剤の4.8ミリリットルを追加することにより、狭いバイアルを準備します。
細いバイアルを氷のバケツに入れ、バケツ、ペーパータオル、ホイル、テープをインキュベーターに持って行きます。ハエを収集するには、狭いバイアルに漏斗を置き、ハエのバイアルからキャップを取り外し、すぐに漏斗に反転します。静かにハエを固定剤のバイアルに導くのに役立ちます。
男性を収集する場合は、1つの狭いバイアルに50ハエの2つのバイアルを組み合わせます。ホイルでZT13とZT19のバイアルを包みます。ハエを移した後、こぼれを避けるためにキャップをテープで貼ります。
バイアルを165 RPM、摂氏4度で4時間ヌゲーティングミキサーに置きます。ハエはもはや光に敏感ではないので、ホイルはハエが固定剤に沈められていることを確認するために取り除かれるかもしれない。ヌゲーティングミキサーからバイアルを取り外した後、ホルムアルデヒドを取り除き、1X PBSの3000マイクロリットルでハエを3回洗い、各洗浄中にバイアルを反転します。
バイアルを摂氏4度で保存し、将来の免疫蛍光を待ちます。光と闇は、概日周期にハエを巻き込むために使用されました。エントレインメントは、免疫ブロッティング、および経日封じ込め用マーカーである期間タンパク質の免疫蛍光分析によって検証された。
細胞全体抽出物の免疫ブロット法は、緊張したハエの頭部から調製し、期間タンパク質移動度および強度の正規パターンを示す。ZT1で採取された、エントレーニングされた脳の免疫蛍光は、特徴的なパターンで期間タンパク質を示す。この方法は、免疫蛍光、免疫プロット、免疫沈降、行動分析、および生物学的時計が刻むにつれて経路がどのように変化するかを比較するために使用する可能性のある他の技術のための飛び降りポイントです。
モデル生物をエントレインする能力を使用すると、お気に入りの経路が時間の経過とともに変化するかどうか、および好きな経路の影響が生物学的破壊につながるかどうかを尋ねることができます。生物学的時計が破壊されると、多くの病気が悪化する。根本的なメカニズムを特定することは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの病気に苦しむ人々のためのより効果的な薬を作成するのに役立ちます。
