Синхронизация дрозофилы для определения циркадных времен является первым шагом в изучении событий, которые либо контролируют, либо реагируют на биологические часы. Синхронизация всех моделей будет следовать одному и тому же базовому подходу. Есть много шагов, чтобы сделать это практично, и это может показаться подавляющим, чтобы положить их все вместе.
Ожидайте попробовать несколько раз, прежде чем он чувствует себя естественно. Держите температуру стабильной, и я хочу, чтобы свет в течение трех минут шаги. Подготовка пищи мухи в Крок-Пот при 121 градусов по Цельсию, смешивания в качестве ингредиентов добавляются.
Обложка Крок-Пот и довести содержимое до кипения, смешивая содержимое каждые 10 минут. Через 20 минут на катящийся кипяток, выключите огонь, и добавить 83,6 миллилитров воды в Крок-Пот. Оставьте крышку, как пища охлаждается.
Пока пища охлаждается, перемешайте ее каждые 10 минут, чтобы не позволить пленке сформироваться на вершине. Также измеряйте температуру каждые 10 минут со стеклянным термометром. После того, как пища остынет ниже 60 градусов по Цельсию, добавьте тегосепт и пропионовую кислоту, как описано в рукописи.
Хорошо перемешать и настроить Крок-Пот для поддержания температуры, всего на несколько градусов меньше, чем 60 градусов по Цельсию. Используйте перистальтический насос для распределения пищи мухи. Для узких флаконов, насос 10 миллилитров, а для шести унций квадратных нижних бутылок, насос 60 миллилитров.
Храните диких мух типа при 25 градусах по Цельсию в течение 10 до 12 дней, пока около 200 куколок не будут прикреплены к внутренностям бутылки. Чтобы удалить взрослых из бутылки, наконечник их в новую бутылку, и использовать скучный конец числа нулевой кисти, чтобы подтолкнуть всех оставшихся взрослых дюйма Протрите кисть 70%этанолом до и после использования.
Инкубировать куколки при 25 градусах по Цельсию, чтобы следующее поколение, чтобы выйти. Через три дня мухам будет от нуля до трех дней. Помните, что температура, свет, и даже ваш выбор пищи будет влиять на увлечение.
Будьте уверены, чтобы сохранить их, каждый контроль во время эксперимента. В назначенное время для сбора, использовать углекислый газ анестезии площадку для обездвиживания мух, и собирать 100 мужчин и 100 женщин. Самки мух намного крупнее самцов.
Мухи также могут быть дифференцированы путем изучения гениталий. Мужчины имеют темные округлые гениталии, в то время как женщины имеют более светлые, более остроконечные гениталии. Поместите самцов и самок в отдельные флаконы со 100 самками на флакон и 50 самцами на флакон.
Мужские социальные взаимодействия приводят к много смертей, когда Есть 100 человек во флаконе. Для того, чтобы циркадные увлечение происходит, поместите флаконы в свет регулируется инкубаторов в течение трех-пяти дней. Для производства мух для будущего вовренирования поместите 25 оставшихся самок и пять-семь оставшихся самцов в новую бутылку.
Инкубировать бутылку при 25 градусах по Цельсию. На каждые 100 мух, которые будут собраны. Подготовьте узкий флакон, добавив 4,8 миллилитров фиксатора.
Поместите узкие флаконы в ведро со льдом и возьмите ведро, бумажные полотенца, фольгу и ленту к инкубатору. Чтобы собрать мух, поместите воронку в узкий флакон, затем снимите крышку с флакона мух и быстро переверните ее в воронку. Нажмите осторожно, чтобы помочь направлять мух во флакон фиксатора.
Собирая самцов, смешайте два флакона по 50 мух в один узкий флакон. Оберните флаконы для ЗТ13 и ЗТ19 в фольгу. После передачи мух, лента шапки на месте, чтобы избежать разлива.
Поместите флаконы на Nutating Mixer при 165 об/мин и четыре градуса по Цельсию в течение четырех часов. Мухи больше не светочувствительны, так что фольга может быть удалена, чтобы убедиться, что мухи погружаются в фиксатор. После удаления флаконов из Nutating Mixer, удалить формальдегид, а затем мыть мух три раза с 3000 микролитров 1X PBS, инвертирование флакона во время каждой стирки.
Храните флаконы при четырех градусах по Цельсию, чтобы дождаться будущего иммунофлюоресценции. Свет и тьма использовались для того, чтобы перегнать мух в циркадные циклы. Энтрейнция была проверена иммуноблоттингом и иммунофлуоресценцией белка периода, маркером циркадного обучения.
Иммуноблотинг экстрактов целых клеток, приготовленный из голов обученных мух, показывает каноническую закономерность подвижности и интенсивности белкового периода. Иммунофлуоресценция перенапряженного мозга, собранная при ЗТ1, показывает периодовые белки в характерной структуре. Этот метод является прыжки с точки для иммунофлуоресцентных, иммуноплоттинг, иммунопреципиентность, поведенческий анализ, и любой другой метод, который вы можете использовать, чтобы сравнить, как путь изменения, как биологические часы клещей.
С возможностью увязать ваш модель организма, вы можете спросить, если ваш любимый путь меняется с течением времени, и является ли эффект в вашем любимом пути может привести к нарушению биологического. Ряд заболеваний усугубляется, когда биологические часы нарушается. Выявление основных механизмов поможет нам создать более эффективные лекарства для людей, страдающих от таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
