静脉畸形的患者衍生异种移植模型

该协议可用于创建患者衍生的异种移植，重新概括静脉畸形的异质体。这进一步被允许进行我们的临床前治疗测试。该技术提供了一个快速可靠的NVivo系统，允许每天监测患者直接内皮细胞的生长和对实验治疗的反应。

这种方法可以很容易地适应研究其他类型的血管或淋巴异常。首先准备注射细胞悬浮液。在37摄氏度下用5毫升预加热0.05%的edin-EDTA对内皮细胞进行试穿，两分钟。

中和行程，加入五毫升EGM，将细胞收集到150毫升锥形管中。将其离心至400倍G5分钟，然后吸升，然后用三毫升EGM重新暂停细胞。用血细胞计计算细胞。

将所需细胞号的体积冒入新的50毫升锥形管中，通过离心再次对细胞进行颗粒状。吸上液留下一个小体积来松开细胞颗粒。每次注射用220微升BMEM重新注入细胞颗粒。

将细胞悬浮液完全混合在冰上，确保避免产生气泡。通过拉动柱塞将 BMEM 细胞培养混合物吸入一毫升注射器开口。您将将 26 量无菌针头锁定在注射器上，并在注射前将准备好的注射器平放在冰上。

在确保小鼠正确麻醉后，将其放在胃部，用70%乙醇对注射区域进行消毒。轻轻滚动准备好的注射器，以重新注入任何已结算的细胞。将气泡剥到注射器的末尾，并排出一小卷细胞悬浮液。

在注射部位捏皮，形成像结构一样帐篷。然后将针头插入皮肤下，通过释放捏皮防止注射到肌肉组织，确保针头只是皮肤深。持针稳稳地小心地注射200微升的细胞悬浮液，形成小球形质量。

注意避免将细胞悬浮液注射到肌肉中。使用卡钳测量每个插头的长度和宽度。将解剖的异种移植插头对齐在尺子旁边的切割板上，并拍摄图像以记录病变的血管总。

然后通过将插头淹没在室温下过夜 10% 的甲醛来固定插头。解剖后，病变塞被处理进行组织学分析，并染色为UEA-1检测插头内的人类衍生内皮细胞。在病变部分内的 X 平面图案中，用明亮的场显微镜在 20 X 放大时拍摄每个病变部分的 5 张 HPF 图像，以避免重叠。

请确保在拍摄的图像上包含比例条。打开图像中的 HPF 图像J.To校准比例栏的像素，使用直线工具并查看比例图条。然后，通过单击"分析"和"设置比例"将测量的像素转换为毫米。

接下来单击"分析集测量"并选择区域并添加到叠加。使用分析和测量来测量 HPF 的总字段面积，从而保存此测量值以进行定量测量。使用自由手选择工具手动勾勒出 UEA-1 正血管通道。

单击"分析和测量"以量化概述区域。测量 HPF 内的所有血管通道。对每个部分中采取的五个 HPF 重复此过程，然后将值转移到 Excel 以进行进一步分析。

然后根据手稿方向计算血管面积和血管密度的百分比。使用此协议，TIE2 或 PIK3CA 多活性突变内皮细胞的病变塞在注射后 7 至 9 天内明显血管化并扩散。病变塞与人体VM组织特征相似，由一层薄薄的内皮细胞对齐的大血管是可见的。

这些血管结构通常含有红细胞，确认功能性脑膜病与宿主小鼠血管。使用人类特异性卵石UEA-1的免疫组织化学染色证实，血管区域内衬细胞来自人类植入细胞，而不是小鼠血管。按照这个程序，可以执行增殖或凋亡标记的病变部分的额外染色，以分析实验治疗的具体效果。

此造化模型已用于静脉畸形新疗法的临床前研究，如 mTOR 抑制剂拉帕霉素，在 VM 患者的多项临床试验中显示出疗效。