Questo protocollo può essere utilizzato per creare xenoinnesti derivati dal paziente che ricapitolano l'istopatologia delle malformazioni venose. Questo è stato ulteriormente permesso di portare i nostri test terapeutici preclinici. Questa tecnica fornisce un sistema NVivo veloce e affidabile che consente il monitoraggio quotidiano della crescita delle cellule endoteliali dirette del paziente e la risposta alla terapia sperimentale.
Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per indagare altri tipi di anomalie vascolari o linfatiche. Iniziare preparando la sospensione cellulare per l'iniezione. Tripsinare le cellule endoteliali con cinque millilitri di pre-riscaldato 0,05% tripsin-EDTA a 37 gradi Celsius per due minuti.
Neutralizzare la tripsina e aggiungendo cinque millilitri di EGM e raccogliere le cellule in un tubo conico da 150 millilitri. Centrifugarlo a 400 volte G per cinque minuti, quindi aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di EGM. Conta le cellule con un emocitometro.
Avventurare il volume con il numero di cella desiderato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e pelletare nuovamente le cellule mediante centrifugazione. Aspirare il supernatante lasciando un piccolo volume per allentare il pellet cellulare. Resuspend il pellet cellulare con 220 microlitri di BMEM per iniezione.
Mescolare accuratamente la sospensione cellulare sul ghiaccio assicurandosi di evitare di creare bolle. Aspirare la coltura cellulare BMEM mescolare in un'apertura di siringa millilitro tirando lo stantuffo. Bloccherai un ago sterile calibro 26 alla siringa e manterrai le siringhe preparate piatte sul ghiaccio prima dell'iniezione.
Dopo aver fatto in modo che il mouse lo abbia anestetizzato correttamente, posizionarlo sullo stomaco e disinfettare la regione di iniezione con il 70% di etanolo. Arrotolare delicatamente la siringa preparata per rimondere le cellule sistemate. Scaglie all'estremità della siringa ed espellere un piccolo volume della sospensione cellulare.
Pizzicare la pelle nel sito di iniezione per creare una struttura simile a una tenda. Quindi inserire l'ago proprio sotto la pelle e assicurarsi che l'ago sia solo profondo della pelle rilasciando la pelle di pizzico per prevenire l'iniezione nel tessuto muscolare. Tenendo l'ago costantemente accuratamente iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare per creare una piccola massa sferica.
Fare attenzione a evitare di iniettare la sospensione cellulare nel muscolo. Misurare la lunghezza e la larghezza di ogni spina con una pinza. Allineare le spine di xenoinnesto sezionate su un tagliere accanto a un righello e scattare un'immagine per registrare la vascolarizzazione lorda delle lesioni.
Quindi fissare le spine immergendole in formalina al 10% durante la notte a temperatura ambiente. Dopo la dissezione, i tappi di lesione vengono elaborati per l'analisi istologica e macchiati per UEA-1 per rilevare le cellule endoteliali derivate dall'uomo all'interno della spina. Scatta cinque immagini HPF per sezione di lesione con un microscopio a campo luminoso a ingrandimento di 20 X in un modello di piano X all'interno della sezione della lesione per evitare sovrapposizioni.
Assicurati di includere una barra di scala nelle immagini scattate. Aprire le immagini HPF nell'immagine J.To calibrare i pixel della barra di scala, usare lo strumento linea retta e passare sopra la barra di scala. Quindi convertire i pixel misurati in millimetri facendo clic su Analizza e imposta scala.
Fare quindi clic su Analizza misure impostate e selezionare l'area e aggiungere alla sovrapposizione. Misurare l'area di campo totale dell'HPF utilizzando analizzare e misurare il risparmio di questa misurazione per la quantificazione. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera delineare manualmente il canale vascolare positivo UEA-1.
Fate clic su Analizza (Analyze) e misura (Measure) per quantificare l'area delineata. Misurare tutti i canali vascolari all'interno dell'HPF. Ripetere il processo per i cinque HPF prelevati all'interno di ogni sezione e trasferire i valori in Excel per ulteriori analisi.
Quindi calcolare la percentuale di area vascolare e densità vascolare in base alle direzioni del manoscritto. Utilizzando questo protocollo le spine di lesione con cellule endoteliali mutanti iperattive TIE2 o PIK3CA vengono visibilmente vascolarizzate e perfuse entro sette o nove giorni dall'iniezione. Le spine di lesione assomigliano molto alle caratteristiche istopatologiche del tessuto VM umano e sono visibili grandi canali vascolari allineati da un sottile strato di cellule endoteliali.
Queste strutture vascolari contengono tipicamente eriociti che confermano l'anastomosi funzionale con la vascolarizzazione del topo ospite. La colorazione immunoistochimica utilizzando la lettatina specifica dell'uomo UEA-1 conferma che le cellule che rivestono regioni vascolari sono derivate da cellule impiantate dall'uomo piuttosto che dalla vascolarizzazione del topo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori macchie di sezioni di lesione per marcatori di proliferazione o apoptosi per analizzare effetti specifici dei trattamenti sperimentali.
Questo modello scenografico è stato utilizzato per studi preclinici di nuove terapie per la malformazione venosa, come l'inibitore mTOR rapamicina, che ha dimostrato efficacia in diversi studi clinici per pazienti con VM.
