이 프로토콜은 정맥 기형의 조직 병리학을 재구성하는 환자 유래 제노이식을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 우리의 전임상 치료 시험을 더 할 수 있었습니다. 이 기술은 환자 직접 내피 세포의 성장과 실험 치료에 대한 반응의 매일 모니터링을 허용하는 빠르고 신뢰할 수있는 NVivo 시스템을 제공합니다.
이 방법은 쉽게 혈관 또는 림프 이상의 다른 유형을 조사하기 위해 적응 될 수있다. 먼저 주사를 위해 세포 현탁액을 준비합니다. 2 분 동안 섭씨 37도에서 사전 따뜻하게 0.05 %의 섭씨 0.05 %의 5 밀리리터로 내피 세포를 트립시니얼.
트립신을 중화시키고 EGM의 5 밀리리터를 추가하여 세포를 150 밀리리터 원내 튜브로 수집합니다. 원심 분리는 5 분 동안 400 배 G로 한 다음 슈퍼 나탄을 흡인하고 EGM의 3 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 혈전계로 세포를 계산합니다.
원하는 세포 수로 부피를 새로운 50 밀리리터 원판 튜브로 벤처하고 원심분리에 의해 세포를 다시 펠릿하게 한다. 셀 펠릿을 풀기 위해 소량을 남기는 슈퍼네티티를 흡인합니다. 주사 당 BMEM의 220 마이크로 리터와 세포 펠릿을 다시 중단.
거품을 만들지 않도록 얼음에 셀 서스펜션을 철저히 섞습니다. BMEM 세포 배양 믹스를 플런저를 당겨 서 1 밀리리터 주사기 개구부로 혼합한다. 26 게이지 멸균 바늘을 주사기에 잠그고 주입 하기 전에 얼음위에 준비된 주사기를 평평하게 유지합니다.
마우스가 제대로 마취되었는지 확인 한 후 위장에 배치하고 70 %의 에탄올로 주사 부위를 소독합니다. 준비된 주사기를 부드럽게 굴려 정착된 세포를 다시 보냅니다. 플레이크는 주사기의 끝으로 거품을 내고 셀 서스펜션의 소량을 추방한다.
주사 부위의 피부를 꼬집어 구조와 같은 텐트를 만듭니다. 그런 다음 피부 바로 아래에 바늘을 삽입하고 바늘이 근육 조직에 주입을 방지하기 위해 핀치 피부를 방출하여 피부 깊숙이 있는지 확인하십시오. 바늘을 꾸준히 조심스럽게 주입 200 작은 구형 질량을 만들기 위해 세포 현탁액의 마이크로 리터.
근육에 세포 현탁액을 주입 하지 않도록 주의. 캘리퍼로 각 플러그의 길이와 너비를 측정합니다. 눈금자 옆 도마에 해부된 제노이식 플러그를 정렬하고 이미지를 사용하여 병변의 총 혈관을 기록합니다.
그런 다음 실온에서 하룻밤 사이에 10 %의 포르말린에 잠급하여 플러그를 고정하십시오. 해부 후, 병변 플러그는 조직학적 분석을 위해 처리되고 UEA-1을 위해 염색되어 플러그 내에서 인간 유래 내피 세포를 검출한다. 겹침을 피하기 위해 병변 섹션 내의 X 평면 패턴에서 20 X 배율에서 밝은 필드 현미경으로 병변 섹션당 5 개의 HPF 이미지를 가져 가라.
촬영한 이미지에 배율 막대를 포함해야 합니다. 이미지에서 HPF 이미지를 열고 스케일 막대의 픽셀을 보정하고 직선 도구를 사용하고 스케일 막대를 통과 J.To합니다. 그런 다음 측정된 픽셀을 분석 및 설정 배율조정을 클릭하여 밀리미터로 변환합니다.
다음으로 측정 설정 분석 및 영역을 선택하고 오버레이에 추가합니다. 이 측정을 분석하고 측정하여 HPF의 총 필드 영역을 측정하여 정량화를 위해 이 측정을 저장합니다. 무료 손 선택 도구를 사용하여 수동으로 UEA-1 양성 혈관 채널을 간략하게 설명합니다.
분석 및 측정을 클릭하여 설명된 영역을 정량화합니다. HPF 내의 모든 혈관 채널을 측정합니다. 각 섹션에서 가져온 5개의 HPF에 대한 프로세스를 반복하고 값을 Excel로 전송하여 추가 분석을 수행합니다.
그런 다음 원고 방향에 따라 혈관 영역 및 혈관 밀도의 백분율을 계산합니다. 이 프로토콜을 사용하여 TIE2 또는 PIK3CA 활동적인 돌연변이 내피 세포를 가진 병변 플러그는 주사 후 7~9일 이내에 눈에 띄게 혈관화되고 침투된다. 병변 플러그는 인간 VM 조직의 조직 병리학적 특징과 밀접하게 유사하며 내피 세포의 얇은 층에 의해 정렬된 큰 혈관 채널이 보입니다.
이러한 혈관 구조는 전형적으로 숙주 마우스 혈관과 기능성 해부학을 확인하는 적혈구를 함유하고 있다. 인간 특이렉틴 UEA-1을 이용한 면역히스토케미칼 염색은 혈관 부위를 안감하는 세포가 마우스 혈관보다는 인간 이식된 세포로부터 유래되는 것을 확인한다. 이 절차에 따라, 증식 또는 석멸의 마커에 대한 병변 섹션의 추가 염색을 실험 치료의 특정 효과를 분석하기 위해 수행 될 수있다.
이 scenographic 모형은 VM 환자를 위한 몇몇 임상 시험에서 효험을 보여주었던 mTOR 억제제 라파마이신과 같은 정맥 기형에 대한 새로운 치료의 전임상 연구 결과를 위해 이용되었습니다.
