Dieses Protokoll ermöglicht eine in vitro eingehende Untersuchung der ovariellen Mikroumgebung. Ermöglicht es Benutzern, das Wachstum und die Entwicklung von Follikeln sowie die Steroidogenese und die Häufigkeit von Immunmolekülen zu bestimmen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Veränderungen in der ovariellen Mikroumgebung und den entstehenden Follikeln direkt zu bewerten und das einzigartige Zusammenspiel zu beurteilen, das durch die Zugabe spezifischer Hormone verursacht wird.
Diese Technik kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Fortpflanzungsstörungen zu untersuchen, die follikuläre Verhaftungen verursachen. Zum Beispiel polyzystisches Ovarialsyndrom. Da wir die ovarielle Mikroumgebung in vitro direkt bewerten können, wird Brooke Bell, eine Bachelor-Forscherin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren.
Mit einer zerzierten Kieferzange den Eierstock sichern, in zwei Hälften schneiden und beginnen, äußere Scheiben zu entfernen. Sicherstellen, dass nicht mehr als ein bis zwei Millimeter Tiefe der Oberfläche vom Eierstock abgeschnitten wird, so dass keine Medulla gesammelt wird. Schneiden Sie drei bis vier dünne Streifen des Ovarialkortex mit einem Skalpell ab und legen Sie die Streifen in die dritte PBS-gefüllte Petrischale.
Schneiden Sie die Streifen mit einer Skalpellklinge in kleine quadratische Stücke von 0,5 bis einem Kubikmillimeter. Verwenden Sie ein Lineal unter den Petrischalen, um sicherzustellen, dass die Stücke von ähnlicher Größe und Dicke sind, um konsistente ovarielle Kortexstücke herzustellen. Waschen Sie ovarielle kortikale Stücke in allen drei PBS- und Antibiotikafeld-Petrischalen und verwenden Sie eine gebogene Zehenzange, um die Stücke zwischen den Wäschen zu bewegen.
Bewegen Sie Cortex-Stücke durch die Reihe von LB-15-Waschungen und legen Sie sie in eine letzte LB-15-gefüllte Petrischale. Beschriften Sie den Deckel mit dem Tierausweis und der Eierstockseite. Sammle vier Eierstockkortexstücke pro Eierstock und fixiere sie für die Histologie am Tag Null und friere zusätzliche Stücke für die RNA-Reinigung ein.
Verwenden Sie die verbleibenden Gewebestücke für die Kultur. Bereiten Sie eine biologische Sicherheitswerkbank für eine abschließende Gewebewäsche und Kulturvorbereitung vor. Desinfizieren Sie die Vorräte mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in die biologische Sicherheitswerkbank stellen.
Bewegen Sie alle für die Kultur bestimmten Teile des Ovarialkortex in die biologische Sicherheitswerkbank und waschen Sie sie noch einmal in einer mit LB-15 gefüllten Petrischale. 350 Mikroliter Waymouth-Medium pro Vertiefung werden in eine 24-Well-Gewebekulturplatte pipettiert. Legen Sie unbeschichtete Kulturmuldeneinsätze mit einer Pinzette in jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen unter der Basis des Einsatzes bilden.
Positionieren Sie vorsichtig und vorsichtig vier ovarielle Kortexstücke auf dem Netz jedes Einsatzes, ohne das Netz zu durchstechen. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Wechseln Sie das Kulturmedium des Ovarialkortex täglich für sieben Tage und stellen Sie sicher, dass Sie vorgewärmtes Waymouth-Medium verwenden.
Heben Sie während des Mediumwechsels mit einer Pinzette den Einsatz vorsichtig aus dem Brunnen und sammeln Sie das kultivierte Waymouth-Medium in 0,5-Milliliter-Röhrchen. Setzen Sie den Einsatz wieder in den Brunnen und fügen Sie 350 Mikroliter frisches Kulturmedium hinzu, indem Sie es zwischen der Seite des Einsatzes und dem Brunnen verteilen. Lagern Sie das gesammelte Medium aus der Gewebekultur bei minus 20 Grad Celsius.
Nach sieben Tagen Kultur können Sie die Teile des Ovarialkortex mit einem Dissektionsmikroskop mit einer angeschlossenen Kamera und einem Computer-Imaging-Softwareprogramm abbilden. Fixieren Sie zwei Ovarialrindenstücke pro Vertiefung in Bouins Lösung für die Histologie und schockieren Sie in eieralen Kortexstücken in flüssigem Stickstoff, um RNA für cDNA zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Vertiefungen mit Gewebe, sammeln Sie dann das Medium vom siebten Tag an und lagern Sie es minus 20 Grad.
Lassen Sie die Eierstockkortexstücke etwa 1,5 Stunden in Bouins Lösung eintauchen, waschen Sie sie dann dreimal mit 70% Ethanol, bewahren Sie das Gewebe in 70% Ethanol auf und reinigen Sie es täglich, bis die Lösung nicht mehr gelb ist. Hämatoxylin- und Eosinfärbung wurde für primordiale Follikel, frühe primäre Follikel, primäre Follikel, sekundäre Follikel und Antralfollikel durchgeführt. Das Follikel-Staging wurde an einem Ovarialkortex durchgeführt, der vor und nach der Kultur fixiert wurde, um die Follikulogenese zu beurteilen.
Der Unterschied in der Morphologie, wie er durch Kollagenablagerung bestimmt wird, kann auf eine Fibrose in der Ovarialrinde von Treppenstufen- oder Kontrollfärsen hinweisen. Ein Vergleich der durchschnittlichen Fläche der picrosiriusroten positiven Färbung pro Ovarialkortex, der zwischen Kontroll- und Treppenstufenfärsen gefüllt ist, wird hier gezeigt. Die tägliche Sammlung des Kulturmediums wurde über drei Tage gepoolt, um die unterschiedliche Steroidhormonproduktion unter Verwendung eines Radioimmunoassays zu beurteilen.
Steroidmetaboliten und Zytokinproduktion wurden auch im Kulturmedium des ovariellen Kortex aus einer Vertiefung für jedes Tier gemessen, das über vier Tage Kultur gepoolt wurde. Je länger das Gewebe sitzt, desto schwieriger kann es sein, damit zu arbeiten. Möglicherweise müssen Sie präzise Schnitte üben.
Diese Technik wird verwendet, um die Auswirkungen auf Signaltransduktionswege zu verstehen, um eine übermäßige Steroidogenese zu retten, um die Auswirkungen überschüssiger Steroide auf die Zytokin- und Chemokinproduktion zu bestimmen und die Auswirkungen auf die Follikelprogression oder den Stillstand im Eierstockgewebe zu bestimmen.
