二部類GAL4-UASシステムは、時空間的に制御された方法で遺伝子発現の遺伝子改変を通じてアノフェレスガンビアの機能的遺伝子解析のための汎用性の高いツールです。このバイナリシステムは、重度のフィットネスコストが誘発された場合でも、トランスジーン発現の表現型特性を持つ実験的アプローチの柔軟性を可能にする。このシステムは、殺虫剤耐性、病原体の伝染、または遺伝的制御方法に使用されているものに関与する可能性のある遺伝子の表向きの特徴付けに使用することができる。

研究技術者のフレイザー・コールマンは、ステレオ顕微鏡での使用に適した透明な平らな皿に端を切り落とした3ミリリットルのプラスチック製パスツールピペットを使用して子犬を収集することで始まるこの手順を実証するのに役立ちます。慎重に子犬の周りの水のほとんどを除去します。蛍光灯をオンにし、ウォームアップできるようにします。

蛍光マーカーのスクリーニング時に予想される表現型の発現と比の色空間パターンを考えてみましょう。蛍光ステレオスコープで必要なフィルターを選択し、ステージプレートの中心に向けられた光の色のビームが見えるように確認します。白色光の下で、子犬を視野に入れ、焦点を合わせます。

白色光を消し、細かい焦点を使って、目に見える蛍光パターンを持つ目的の表現型を運ぶ子犬の領域を焦点にします。細かいディテールペイントブラシを使用して、外的な生殖器を識別できるように、子犬をそっと回し、肛門のパドルを動かします。特徴的な外部生殖器に基づいて別々の子犬。

オスは、肛門パドルの約半分の長さの最終的な後部セグメントから押し出す長いチューブを有する。女性の子犬の外性器はかなり短く、二分です。セックスされた子犬を水で透明な20ミリリットルのチューブで10以下のグループに分け、綿毛のボールでチューブを密封します。

この移動中に成人に損傷を与えないように注意して、チューブから望ましい数の男性と女性の成人をケージまたは小さなバケツに吸引する。十字架は、授乳前に5〜7日間維持します。翌日、卵子を採取して胚の発達を研究することができる。

卵子室を組み立て、慎重に10〜15の血液供給された女性をそれに導入する。卵子チャンバーを覆い、20分間放置します。50ミリリットルのポリプロピレンチューブを卵型ポットから慎重に取り外し、蚊を放出しないようにします。

鍋を覆い、卵が興味のある発達段階に成熟するようにします。細かいディテールペイントブラシを使用してポットから卵を拾い、40平方ミリメートルの発掘ガラスブロックに水の上に置きます。慎重にマイクロピペットでガラスブロックから水を取り出し、FAAの500マイクロリットルで卵をカバーします。

室温で軌道シェーカーで30分間静かに振動する。卵を蒸留水で15回徹底的に洗い流し、FAA溶液のすべての痕跡を取り除きます。1000マイクロピペットを使用して、追加し、その中に卵を損傷しないように注意して、一度に蒸留水の1ミリリットルを削除します。

固定卵を1ミリリットルのTrpis溶液で覆い、室温で30分間インキュベートします。卵は、5分間のインキュベーションの後、最終的に白色に達すると淡いパッチを開発し始めます。卵を蒸留水で15回十分に洗い流し、Trpis溶液のすべての痕跡を取り除きます。

3xP3プロモーターによって駆動される蛍光マーカーの発現は、アノフェレスガンビアの眼および腹側神経節で観察される。異なる色の蛍光マーカーを使用することで、異なるGAL4成分とUAS成分を持つ修飾者の選択とスクリーニングが可能になります。二国間GAL4-UASシステムを使用する場合、GAL4とUASの両方のコンポーネントを運ぶ子孫を獲得するために、異なる株から男性と女性を横断する必要があります。

男性と女性の子犬の外性器で観察される差動形態は、セックスに使用されます。ここでは、識別できない子犬の例を紹介します。右側に示すように、子犬からすべての水を除去すると、肛門のパドルが生殖器の視覚化をあいまいにするので、セックスの難しさを増加させます。

二部のGAL4-UASシステムは制御された時空間的な方法で遺伝子発現の修飾を可能にする。これは、応答線UAS-mCherryでドライバーラインを表現するオエノサイトとユビキタスGAL4 4を横断することによって視覚化することができます。二国間GAL4-UASシステムを使用することの主な利点は、胚期でも致死的表現型を研究することの容易さである。

これを行うには、胚の内部形態を可視化する必要がある。胚除去プロトコルの完成後、12、24、および36時間の胚発生の異なる段階で観察された正常な形態学的特徴が見られる。この手順を通じて、子犬と卵を乾燥させることはできません。

したがって、液体を取り除くときに迅速に作業することが重要です。GAL4-UAS法により、殺虫剤耐性に関与する遺伝子や、遺伝子駆動制御法に潜在的な用途を持つ遺伝子を機能的に特徴付けることができています。