使用共聚焦显微镜研究 利什曼原虫 的吞噬作用

利什曼原虫感染中吞噬作用的相关机制仍然知之甚少。在这里，我们描述了评估利什曼原虫与宿主细胞相互作用期间早期固化状态的方法。该技术作为主要优点，允许研究利什曼原虫吞噬作用的不同状态和几种蛋白质的参与。

值得注意的是，这种技术也可以扩展到其他类型的研究，包括细菌、酵母菌感染，或者被其他类型的细胞吞噬。尝试这种技术的人应该注意细胞暴露于核苷酸溶液的时间。此外，我们建议开始测试转染，最多使用两个质粒。

演示该程序的将是来自我们实验室的博士生Amanda Reboucas。首先，在带有13毫米玻璃盖玻片的24孔板上接种每孔500微升RPMI的020万个THP-1细胞或人单核细胞衍生巨噬细胞。在37摄氏度下在5%二氧化碳下孵育24小时，用0.9%盐水洗涤细胞两次，并将细胞在完整的RPMI培养基中孵育。

向细胞中加入固定相利什曼原虫种属，以10个寄生虫与一个宿主细胞的比例，然后，在4摄氏度下以720倍g离心10分钟。将细胞在四摄氏度下孵育五分钟后，用0.9%盐水溶液洗涤细胞两次，以去除任何未内化的前鞭毛。将细胞在补充的RPMI培养基中在37摄氏度下孵育一小时，然后用4%PFA固定细胞15分钟。

接下来，使用首选的封片介质安装盖玻片。然后，在荧光显微镜下在随机场中计数至少400个细胞。为了研究利什曼原虫诱导的PV生物发生，通过将1500万个THP-1细胞接种在75平方厘米的组织培养瓶中，将1500万个THP-1细胞接种在含有10毫升完全RPMI培养基（补充有100纳克/毫升PMA）和50微摩尔至巯基乙醇中48小时，开始用质粒转染THP-1细胞48小时。

然后，在0.9%盐水溶液中洗涤细胞一次，并使用非酶细胞解离溶液分离细胞。然后，在室温下以250倍g离心5分钟。接下来，将THP-1细胞重悬于一毫升RPMI培养基中，并在Neubauer室中进行计数。

在室温下再次以250倍g离心细胞10分钟，弃去上清液。将200万个细胞重悬于100微升的核苷酸溶液中，并与0.5微克质粒包被孵育，以获得用荧光蛋白标记的目标蛋白。将含有THP-1细胞和核酸的悬浮液转移到核素比色皿中。

然后，使用核苷程序Y一转染细胞。在 500 微升 RPMI 培养基中回收转染的细胞和种子，该培养基在 24 孔板上使用13毫米玻璃盖玻片。将细胞和完全RPMI培养基在37摄氏度下孵育0.5、2、4、6、12和24小时。

将 13 毫米玻璃盖玻片置于室温下，并在采集前至少 30 分钟保护它们免受光照。用吸收性纸巾清洁盖玻片。接下来，向物镜中加入一滴浸油，然后添加幻灯片。

向上移动物镜，直到油接触载玻片。观察并调整显微镜上的焦点，然后选择带油的63x物镜选项。打开 LIQA 程序并调整 488、552 和 405 波长的激光器。

选择图像分辨率为 1024 x 1024。单击实时按钮后，设置 Z 堆栈并按开始选项。等待图像采集，然后在工具中选择选项“最大投影”。

保存实验，并将 TIFF 格式的图像导出到计算机。结果表明，巴西利什曼原虫LCL和巴西利什曼原虫DL与巨噬细胞相似。此外，在宿主细胞吞噬巴西利什曼原虫LCL和巴西利什曼原虫DL吞噬作用方面没有观察到差异。

在感染细胞中比较了LC3募集到由巴西利什曼原虫LCL或巴西利什曼原虫DL诱导的寄生液泡或PV。感染4小时后，观察到巴西利什曼原虫LCL和巴西利什曼原虫DL感染巨噬细胞中LC3修饰PV的百分比相似。因此，结果表明，巴西利什曼原虫LCL和巴西利什曼原虫DL在LC3募集PV的结合，吞噬作用和生物发生过程中与巨噬细胞发生类似相互作用。

代表性的显微图像显示了用PLC-GFP，Rab5-GFP，Rab7-GFP质粒有效转染THP-1细胞。尝试此协议的人必须注意温度孵育并保护显微镜样品免受所有类型的光线照射。调节诱发利什曼原虫吞噬作用的已鉴定蛋白质的表达将证明这些蛋白质在利什曼原虫感染结果中的重要性。

我们可以将这种技术扩展到不同类型的病理学研究和与寄生虫建立和靶标识别相关的机制，以制定治疗策略。