Механизм, связанный с фагоцитозом при инфекции Leishmania, остается плохо изученным. Здесь мы описываем методы оценки ранних состояний излечения во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами. Данная методика представляет собой главное преимущество, позволяющее изучать различные состояния фагоцитоза лейшмании и участие нескольких белков.
Стоит отметить, что этот метод также может быть распространен на другие типы исследований, включая заражение бактериями, дрожжами или поглощение другими типами клеток. Люди, пробующие эту технику, должны позаботиться о времени воздействия на клетки раствора нуклеофектора. Кроме того, мы предлагаем начать тестирование трансфекции с использованием максимум двух плазмид.
Продемонстрировать процедуру будет Аманда Ребукас, аспирант из нашей лаборатории. Начнем с того, что посейте 0,2 миллиона клеток THP-1 или человеческих моноцитарных макрофагов в 500 микролитров RPMI на скважину на 24-луночную пластину с 13-миллиметровыми стеклянными крышками. Инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия при 5% углекислого газа, дважды промывайте клетки 0,9% физиологическим раствором и инкубируйте клетки в полной среде RPMI.
Добавьте стационарную фазу вида Leishmania к клеткам при 10 паразитов с соотношением клеток-хозяев, а затем центрифугу в 720 раз в g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После инкубации клеток при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут дважды промывайте клетки 0,9% физиологическим раствором, чтобы удалить любые неинтернализованные промастиготы. Инкубируйте клетки в дополненной RPMI среде при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, а затем зафиксируйте клетки с 4% PFA в течение 15 минут.
Затем смонтируйте крышки с помощью предпочтительного монтажного носителя. Затем подсчитайте не менее 400 клеток в случайных полях под флуоресцентным микроскопом. Чтобы исследовать биогенез PV, вызванный лейшманией, начните трансфектацию клеток THP-1 плазмидой, посеяв 15 миллионов клеток THP-1 в колбы для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров, содержащие 10 миллилитров Complete RPMI Medium, дополненных 100 нанограммами на миллилитр PMA, и 50 микромоляров в меркаптоэтанол в течение 48 часов.
Затем промыть клетки один раз в 0,9% физиологическом растворе и отделить клетки с помощью неферментативного раствора для диссоциации клеток. Затем центрифугируют в 250 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте ячейки THP-1 в одном миллилитре RPMI Medium и выполните подсчет в камере Нойбауэра.
Центрифугируют клетки снова в 250 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Повторно суспендировать 2 миллиона клеток в 100 микролитрах раствора нуклеофектора и инкубировать с 0,5 мкг плазмидного покрытия для интересующего белка, помеченного флуоресцентным белком. Перенесите суспензию, содержащую клетки THP-1 и нуклеиновую кислоту, в кювету нуклеофектора.
Затем трансфектируйте клетки с помощью программы Нуклеофектора Y one. Восстановите трансфектированные клетки и посейте семена в 500 микролитров RPMI Medium на 24 пластинах скважины с 13-миллиметровыми стеклянными крышками. Инкубируйте клетки и полную rpmI-среду при 37 градусах Цельсия в течение 0,5, 2, 4, 6, 12 и 24 часов.
Оставьте 13-миллиметровые стеклянные крышки при комнатной температуре и защитите их от света не менее чем за 30 минут до приобретения. Очистите покровы абсорбирующей тканью. Затем добавьте каплю погружного масла к объекту, а затем добавьте слайд.
Перемещайте объектив вверх, пока масло не коснется слайда. Наблюдайте и регулируйте фокусировку на микроскопе и выбирайте вариант объектива 63x с маслом. Откройте программу LIQA и отрегулируйте лазеры на длинах волн 488, 552 и 405.
Выберите разрешение изображения 1024 x 1024. После нажатия на живую кнопку установите Z-стек и нажмите опцию start. Дождитесь получения изображения, а затем выберите опцию максимальная проекция в инструментах.
Сохраните эксперимент и экспортируйте изображения в формате TIFF на компьютер. Результаты показали, что и Leishmania Braziliensis LCL, и Leishmania Braziliensis DL, аналогично связываются с макрофагами. Кроме того, не наблюдалось различий в отношении Leishmania Braziliensis LCL и Leishmania Braziliensis DL фагоцитоза клетками-хозяевами.
Рекрутирование LC3 в паразитофорную вакуоль, или PV, индуцированную Leishmania Braziliensis LCL или Leishmania Braziliensis DL, сравнивали в инфицированных клетках. После четырех часов заражения наблюдался аналогичный процент pv-элементов, украшенных LC3, у зараженных макрофагов Leishmania Braziliensis LCL и Leishmania Braziliensis DL. Таким образом, результаты показали, что Leishmania Braziliensis LCL и Leishmania Braziliensis DL одинаково взаимодействуют с макрофагами во время связывания, фагоцитоза и биогенеза PV относительно рекрутирования LC3.
Репрезентативные микроскопические изображения продемонстрировали эффективную трансфекцию клеток THP-1 с помощью плазмид PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Люди, пробующие этот протокол, должны обращать внимание на температурную инкубацию и защищать образцы микроскопа от света, всех типов. Модуляция экспрессии идентифицированных белков, ускоряющих фагоцитоз лейшмании, продемонстрирует важность этих белков в исходе инфекции лейшмании.
Мы можем распространить эту технику на различные типы исследований патологии и механизмов, связанных с установлением паразитов и идентификацией мишеней для разработки терапевтических стратегий.
