粒状棘球绦虫的短暂转导

粒状棘球绦虫的短暂交易。我们使用第三代慢病毒载体描述了粒状棘球绦虫不同发育阶段的快速瞬时转导技术。囊性棘球蚴病或包虫病是由粒状棘球绦虫引起的最重要的人畜共患寄生虫病之一，棘球绦虫是一种藏耙在犬科动物肠道中的小绦虫。

迫切需要应用遗传学研究来了解发病机制和疾病控制和预防。然而，缺乏有效的基因评估系统阻碍了对囊尾寄生虫（包括棘球绦球菌属）功能性遗传学的直接解释。与原生动物寄生虫相比，寄生扁虫的基因转移进展仍然有限。

在过去的二十年中，病毒递送系统的使用已成为转基因递送和基因/蛋白质研究的重要工具。因此，我们评估了GFP报告基因对粒棘球绦虫原细胞和蠕动蠕虫的慢病毒瞬时转导。图1显示了粒状棘球绦虫分期研究方案的示意图。

第一，收集包虫囊肿。从屠宰场经常屠宰的自然感染的绵羊中收集肝脏包虫囊肿。在吸出原结肠之前，使用无菌纱布和70%酒精对囊肿表面完全灭菌。

将 20 至 50 mL 的葡萄液吸出到无菌的 50 mL 锥形管中。排出后，用锋利的刀片吸出囊肿，将生发层转移到无菌的50mL锥形管中，并短时间摇动以增加原结肠的收集。用PBS缓冲液洗涤原结肠三到五次。

在0.1%曙红中观察原结肠5分钟，以确定原结肠在光学显微镜下的生存能力。使用培养存活率至少为95%的原结肠。用两 mL 胃蛋白酶处理原结肠诱发 15 至 20 分钟。

为了分离单个原结肠，将原结肠沉积物重悬于PBS中，并将其通过两层无菌纱布进入新的无菌50 mL锥形管中。二、双相培养粒棘球绦虫原球菌，获得成虫。向每个25平方厘米的培养瓶中加入10mL液相培养基。

向培养瓶中加入约5，000个原结肠并将其转移到CO2培养箱中。24至48小时后，将原双骨菌转移到具有固相的新烧瓶中，并为每个烧瓶加入一mL相同的新鲜液相培养基。将烧瓶转移到培养箱中，37摄氏度，5%CO 2。

每隔五至七天，用新鲜的液相培养基替换培养基。三、单相培养粒棘球绦虫原球菌。确保在转导前24至48小时进行单相培养。

在具有RPMI和10%FBS的25厘米见方的培养瓶中培养约5，000个原结肠。将烧瓶转移到CO2培养箱中直至使用。四、细胞培养用于病毒的生产和制备。

将500， 000个HEK细胞转移到含有5 mL DMEM和10%FBS，100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素的25厘米见方的烧瓶中。将HEK2细胞在37摄氏度的5%CO 2中孵育，每48小时在完整的培养基中传代一次。最后使用低传代HEK细胞进行转导。

五、用第三代慢病毒载体生产和制备病毒。第一天，在6孔培养板中对HEK细胞进行胰蛋白酶消化后，用含有10%FBS的新鲜无抗生素DMEM接种每孔70， 000个细胞。使用汇合度为50%至60%的细胞通过磷酸钙法转导。

第二天，在实验前两到三小时用含有2%FBS的新鲜无抗生素DMEM替换细胞培养基。在 1.5 mL 离心管中，混合第三代慢病毒质粒，包括 7 微克/微升 pCDH513b 转印载体、4 微克/微升 PLPII、4 微克/微升 PLPI 和 2 微克/微升 PMD2G 辅助载体。向混合物中加入HEPES缓冲液以达到422微升的体积。

向混合物中加入16微升1%TE缓冲液。向试管中加入62微升2.5mL氯化钙并充分混合。向混合物中加入500微升2x HBS缓冲液，使用巴斯德移液管在一到两分钟内逐滴。

轻轻混合，直到获得半不透明的溶液，并在室温下孵育混合物20分钟。最后，将混合物缓慢地加入每个板中，并以缓慢的圆周运动分布。将板在37摄氏度的5%CO 2培养箱中孵育，并在4至6小时后用含有10%FBS的无抗生素DMEM替换培养基。

第三天，使用倒置荧光显微镜确认成功的瞬时转导和细胞活力。第四天，通过收集每个孔的上清液从培养基中收获病毒，并将其储存在负70摄氏度直至使用。六、粒状棘球绦虫与病毒不同阶段的短暂转导。

第一天，使用12孔培养板进行基因转移。用完整的DMEM培养基作为内部参比，一式三份培养5， 000至50， 000个HEK细胞。在 RPMI 和 10% FBS 中一式三份培养 150 个新鲜原结肠。

将30条曲状蠕虫一式三份培养成DMEM和10%热灭活FBS。用4微克/mL转染试剂制备100万种病毒的混合物，以转导HEK细胞和蠕虫的不同阶段。将混合物缓慢加入每个板中，并以缓慢的圆周运动分布。

将板在CO2培养箱中孵育4至6小时，温度为37摄氏度，5%CO2.用相同的完整培养基替换每个样品的培养基，以尽量减少转染试剂的毒性作用。第二天，重复前面的两个步骤，以提高HEK细胞，原结肠和蠕动蠕虫的瞬时转导效率。

根据细胞培养基的类型，将所有板在具有相同培养条件的CO2培养箱中孵育24至48小时。第三天，使用荧光显微镜确保转导成功。具有代表性的结果。

在这里，我们描述了一种通过使用第三代慢病毒载体在颗粒棘球绦虫中快速有效的瞬时转导技术。根据我们以前的研究，我们在双相培养基中培养原结肠以获得蠕动的蠕虫。原结肠在六周的体外培养后发育成蠕动的蠕虫。

在双相培养基中观察到粒状棘球绦虫的不同阶段，包括内陷的原结肠，图2A，蒸发的原冠状病毒，图2B和具有第一和第三孕激素形成的曲状蠕虫，图2C通过E.原冠状病毒和从单相和双相培养中获得的蠕动蠕虫分别被表达GFP的慢病毒转染，图3。HEK细胞清楚地表达GFP作为瞬时转导过程控制。成虫在结膜层表达GFP最明显。

然而，原结肠在 48 小时后表现出略低水平的 GFP 表达。原结肠周围的一些囊肿液残留物和/或生发层碎片在转染的样品中引起一些荧光背景。HEK细胞和蠕动蠕虫的荧光强度在24和48小时后增加。

了解线虫和梧桐生物学的分子基础是人畜共患寄生虫致病性的最重要前沿之一。缺乏有效的基因评估系统是直接解释包括棘球绦球菌属在内的蜈蚣虫功能性遗传学的主要障碍。这项工作的主要目的是说明慢病毒载体转导的过程，这在未来的棘球蚴病研究中至关重要。

结果表明，与原结肠相比，蠕动蠕虫对基因的瞬时转导反应更灵敏，这可能是蠕动形式中广泛结膜结构的结果。然而，由于慢病毒转导的性质，多细胞原结肠和絮状蠕虫中的荧光强度通常远低于单层HEK细胞。迫切需要在棘球绦虫的基因组和转录组学水平以及各种寄生和自由生活的扁虫模型系统上进行应用遗传研究。

因此，开发绦虫的基因转移过程为新技术的潜在使用铺平了道路，例如基于病毒的基因图谱或CRISPR-Cas9介导的基因编辑。这项工作在绦虫模型中提出了慢病毒转导，并展示了对扁虫生物学具有潜在影响的有希望的结果。然而，需要更深入的研究来改进这些方法，并发展这些技术在未来实验中的适用性。