鸡寄生虫的成核和活体繁殖

建立Eimeria物种的转染方案将有助于推进基因功能的研究，开发新型疫苗，并筛选新的Eimeria药物靶点。利用这项技术，我们实现了几种Eimeria的转染，核分体是促进基因操作在艾默利寄生虫中应用的有用工具。Eimeria的核分为体外无法培养的其他寄生虫的转染提供了参考，并将加速其基因操纵的研究。

如果您第一次尝试这种技术，您应该在转染开始前做好所有试剂及其仪器的准备，以避免在实验过程中争先恐后。这种方法的实现有助于关注Eimeria转染的人看到这个实验的复杂细节。首先释放孢子囊，将1倍10离二氯酸钾溶液中的7个孢子卵母体，5分钟。

用 PBS 洗三次。用一毫升PBS将颗粒重新暂停，然后将混合物转移到15毫升管中。添加一毫米直径的玻璃珠的同等体积，并使用涡流混合器振荡卵母质悬浮液以释放孢子。

每分钟，通过显微镜监测孢子细胞的释放。当超过 90% 的卵母细胞破裂时，停止涡旋。将孢子悬浮液转移到新的 1.5 毫升管中，以 1，600 次 g 离心，5 分钟。

用一毫升50%密度梯度溶液重新沉淀，以10，000倍g离心1分钟。要释放孢子虫，请用排泄物缓冲液重新沉淀，并在42摄氏度的水浴中孵育40至60分钟，以释放孢子虫。在出站期间每五分钟摇动一次管子。

当超过90%的孢子虫被释放时，停止孵育。在 600 次 g 下离心 10 分钟。用一毫升55%密度梯度溶液重新沉淀，以10000倍g离心管一分钟。

用一毫升 PBS 重新暂停沉淀，并使用血细胞计计算孢子。为了收集Eimeria necatrix的第二代美生动物，将鸡肠从蛋黄茎纵向切到蛋黄孔，并在培养皿中用PBS或HBSS轻轻洗三次。将肠切成碎片，并把它们放在一个带消化缓冲液的圆锥烧瓶中。

将烧瓶放在37摄氏度的磁力搅拌器上，用搅拌棒放置30至60分钟，以释放红石。孵育30分钟后，每5分钟通过显微检查监测一次美罗佐石的释放。为了净化美洛佐石，将含有消化的美罗佐石的悬浮液倒入四层纱布中，过滤成50毫升管，以600倍g离心管10分钟。

离心后，丢弃含有肠碎屑的上经剂。将沉淀物与纯化的美罗佐石转移到1.5毫升管中。用一毫升PBS重新暂停沉淀，并使用血细胞计计算美罗佐特。

首先，将孢子虫或梅罗佐特悬浮液在600倍g下离心10分钟。然后丢弃上一液。按照以下顺序，在含有孢子虫或异质的1.5毫升管中加入85微升的核转染缓冲液、10微克质粒和25个限制性酶单位。

将暂停转移到核转染杯上。将杯子放入核转移槽中。使用电源按钮打开核分子设备，然后选择转染过程 U-033。

程序完成后，按核分子设备的 X 按钮，屏幕显示正常，表示分核成功。将 0.5 添加到 Dulbecco 的修改鹰的介质中 0.5 到核分杯中，以停止反应。轻轻混合后，将悬浮液转移到1.5毫升管中。

将核感染寄生虫接种到七天大的鸡体内。通过丁香途径接种Eimeria necatrix的雌激素或Eimeria tenella的孢子虫，但通过静脉注射接种Eimeria acervulina孢子虫。从粪便中收集卵母细胞后，使用荧光素活性细胞分类和每公斤150毫克的苯丙胺来增加转基因人群比例。

该协议已用于转染艾默利寄生虫。在这项研究中，这里显示了Eimeria necatrix的第二代梅龙和梅罗佐石，以及使用密度梯度溶液后，Eimeria tenella的孢子和孢子虫。Eimeria necatrix 感染核感染的雌性动物后，与细胞核感染的雌性细胞的卵母体图像和感染核感染的孢子体后，Eimeria tenella 的卵母体图像表明细胞分切成功。

尝试此过程时，最重要的是确保孢子虫和紫杉石的纯化成功，并使用 50% 密度梯度溶液去除 OS2，同时确保孢子虫和孢子虫更纯化。按照此过程，您可以优化此协议，如转染卵母细胞或孢子，以简化 Eimeria 寄生虫的转染程序。随着Eimeria转染技术的发展，Eimeria的CRISPR-Cas9技术将显著提高对Eimeria的谨慎基因处理，并作为合适的疫苗输送工具应用。