卡利内克特氏菌中神经肽的多方面质谱研究

内源性肽的分析，其比大多数蛋白质小，但比许多消化的肽大，这是一个未被研究的领域。该协议解决了基于质谱的工作流程中的scap。质谱法具有高灵敏度，可用于靶向感兴趣的特定神经肽，或者可以捕获和检测样品中的一系列神经肽。

通过质谱法对神经肽表达的定量和定位可以导致肽治疗的发展和各种疾病的神经肽生物标志物的发现。为了开始神经肽提取，从甲壳类动物中收集脑组织，并使用镊子立即将一个组织放入含有20微升酸化甲醇的0.6毫升管中。向样品中加入150微升酸化甲醇。

将总声波患者时间设置为24秒，脉冲时间设置为8秒。在超声波均质机上暂停时间至15秒，幅度为50%，并在冰上均质样品。将样品在20， 000 GS下以4摄氏度离心20分钟。

用移液器将上清液转移到管中，并在约35摄氏度的真空浓缩器中干燥。对于脱盐，在20微升0.1%甲酸中重建提取的组织样品。涡旋溶液并在室温水浴中超声处理一分钟。

将0.5微升样品涂在pH条上，以确认pH值小于4。在4摄氏度和20， 000 GS下离心30秒。在错觉溶液中准备润湿平衡洗涤液。

用C18树脂获得10微升脱盐头。将脱盐吸头放在设置为15微升的20微升移液器上。用润湿溶液吸出尖端三次，用等协作溶液吸出三次。

在样品中吸出10次，然后在洗涤溶液中洗涤三次，每次洗涤丢弃。通过在每个错觉溶液中抽吸10次以增加乙腈的顺序进行洗脱。在真空浓缩器中干燥所暗示的神经肽。

在五微升0.1%甲酸中重建干燥的脱盐神经肽。涡旋溶液并将其在室温水浴中超声处理一分钟。在 2000 GS 下短暂离心。为了发现神经肽和甲壳组织，将三微升的样品滴移液到疏水膜上。

直接在样品液滴上移液三微升DHB基质。通过上下移液混合溶液。将一微升样品和基质混合物移液到MALDI不锈钢靶板的孔中，并使用移液器尖端将每个混合物分散到样品孔的边缘。

将一微升的一对一口径和基质混合物放入样品附近的孔中。将含有干燥样品斑点的目标板插入MALDI串联飞行时间仪器中。DHB矩阵将激光功率设置为95%，选择自动最佳检测器增益和智能完整样品载体移动模式。

在Z上获取200至3， 200 M范围内的MS光谱，并将每个点的多个光谱相加，以提高神经肽信噪比。用明胶填充半个低温恒温杯，并使其在室温下固化。将剩余的液体明胶在37摄氏度的水浴中保温。

从动物中收集所需的神经元组织，并使用镊子立即将组织浸入含有去离子水的0.6毫升管中一秒钟。将组织放在固体明胶的顶部，并用液体明胶填充冷冻机杯的其余部分。使用镊子定位组织。

将低温恒温杯放在平坦的表面上，用干冰冷冻。对于切片制备，通过将模具切掉，将明胶嵌入的样品从低温恒温器模具中分离出来。通过将一毫升去离子水滴移液到卡盘上，然后将嵌入的组织压到液滴上，将包埋的组织安装到低温恒温器卡盘上。

一旦冷冻移液器，在组织周围有更多的去离子水，以进一步将其固定在卡盘上。以一个细胞的近似厚度切片组织。拇指将每个部分安装到铟锡氧化物涂层的载玻片上，方法是将载玻片的一侧靠近该部分，然后将手指放在载玻片的另一侧，以缓慢加热玻璃并使该部分粘附在载玻片上。

仅出口从头肽。CSV 来自平均局部置信度分数大于或等于 75 的峰值。在肽列表中搜索已知的序列基序，这些基序指示属于特定神经肽家族的神经肽。

选择感兴趣的已知前亲激素氨基酸序列，并使用TB blast N根据数据库搜索查询前亲激素序列。选择目标生物体并将预期阈值算法参数更改为 1000 以包括低分对齐。运行 blast 程序，然后检查结果，在查询序列和受试者序列之间是否具有高同源性分数，从而产生显著的比对。

保存包含核苷酸序列的 FASTA 文件。使用 Expasy 翻译工具将前 pro 激素核苷酸序列翻译成 pre pro 激素肽序列。对于callinectes sapidus选择无脊椎动物线粒体作为遗传密码并运行该工具。

使用信号P检查肽序列中的信号肽序列和激素前裂解位点.这是神经肽的片段谱，在低片段质量误差中具有100%序列覆盖率，最大限值为0.02道尔顿。这是一种神经肽的光谱，也鉴定出具有100%序列覆盖率，但片段离子数量少，因此鉴定的置信度较低。这些是单个神经肽的提取离子色谱图，该神经肽在两次独立和连续的运行中鉴定出来。

即使保留时间略有不同，这仍然可以用于无标记定量，因为时间偏移小于一分钟。这是包含二甲基标记的神经肽的全扫描质谱的一个例子，导致神经肽的轻形式和重形式之间的质量偏移为4.025道尔顿。De Novo测序肽的片段离子质谱显示出良好的片段化覆盖率，其中对每个氨基酸观察到B和/或Y片段离子，质量误差低至0.02道尔顿。

这表明观察到属于甲壳类RYMI神经肽家族的内源性肽。左侧显示了接触井雕刻所有边缘的好点示例。右边显示了坏点的例子。

在MALDI MS对来自愈伤组织组织神经肽的成像后，获得对应于不同神经肽的各种M对Z值的离子分布图像。针对特定分析类型的萃取溶剂优化至关重要。还要确保完全均质化，并根据需要调整方法。

如果未提取，则不会在下游检测到任何内容。该技术可以提供重要神经肽的基础列表，可以作为潜在的生物标志物进一步研究，并在不需要抗体的情况下提供非靶向定位信息。