靶向激光消融术在乳酸杆菌胚胎中的应用

该协议是第一个关于早期海带胚胎的完整激光消融方案。该程序为研究褐藻胚胎发生过程中的细胞命运和相互作用提供了一种可靠的方法。局部细胞激光消融允许在细胞上以高水平的精度和组织进行时间和特殊消融。

这种方法是研究褐藻早期胚胎中细胞命运和相互作用的有希望的方法。它可以应用于其他藻类系统，只需很少的变化。首先对整个培养皿进行成像，以在消融步骤中定位要选择的胚胎，并监测所选胚胎的后续发育。

开始磁贴扫描。记录培养皿的四个基点的位置。输入文本手稿中定义的参数，并以低分辨率获取整个培养皿的透射或荧光图像。

保存图块扫描图像，并在图像采集软件窗口中保持打开状态。在不取下培养皿的情况下更改目标。在扫描中查找感兴趣的胚胎。

要校准激光器，请打开激光驱动器和图像采集软件包。然后初始化激光路径。通过单击激光驱动程序软件包中的"开始采集"来同步两个软件包。

设置激光烧蚀的参数，然后单击实时。选择培养皿上的空白区域，并将载物台水平降低到培养皿顶面以下20微米处，以聚焦在玻璃底部。要查找感兴趣的区域，请单击选择AOI按钮，然后单击紫外激光驱动程序软件包中图像的边缘。

单击开始校准并选择手动校准以设置烧蚀激光和成像激光轨迹。确保所有百叶窗都已打开。选择足够高的激光功率，以便在实时图像的中心看到一个黑点，对应于玻璃盖玻片上的孔。

用鼠标光标单击中央黑点，然后选择软件建议的另外18个点以完成对齐过程。单击单击并触发模式。检查同一盖玻片上的校准，然后单击可见激光冲击的玻璃层。

在瓷砖扫描中选择感兴趣的胚胎，然后单击它来移动舞台。启动时间序列。实时测试时间流逝参数，并在必要时进行调整。

在图像采集软件中以最大速度开始延时记录。调整变焦以聚焦于感兴趣的区域并可视化整个胚胎。要在记录消融过程中跟踪胚胎，请单击按钮，获取最新图像。

将参数设置为45%激光传输，对应于最大40微瓦和1毫秒脉冲持续时间。通过使用激光驱动软件点击和射击功能，对感兴趣的胚胎细胞施加破坏性照射。在688纳米以下，监测自身荧光叶绿体从细胞质中射出的情况。

如果单元格内容保留在单元格中，请再次使用单击并触发功能来增加单元格中违规的大小。重复此过程，直到释放大部分细胞内容，将拍摄次数保持在最低限度。在胚胎稳定后停止延时记录，并且无法检测到进一步的细胞间运动。

更新磁贴扫描图像上的批注，覆盖现有磁贴扫描，然后保存图像。通过监测激光消融后发育的胚胎数量并确定存活率，并将其与死亡胚胎进行比较。通过每天测量激光注射胚胎的长度并将其与完整胚胎进行比较来确定生长延迟。

通过监测与消融细胞相邻的细胞的反应来发现相邻的损伤。感兴趣的靶向细胞是最顶端的细胞，最基底细胞和中间细胞。在对整个培养皿进行瓷砖扫描后，感兴趣的胚胎被确定为激光射击的合适候选者。

当用脉冲紫外激光束以45%的功率射出时，细胞释放其内容物，而与受照射细胞相邻的细胞则扩展到细胞间空间。每24小时记录一次辐照胚胎的位置，持续10天。大多数辐照的胚胎继续发育，但显示出生长改变。

相比之下，用其他激光参数测试的胚胎很快显示出严重压力的迹象，如细胞漂白，褪色或形状变化。几乎所有以这种方式拍摄的胚胎在实验后五天内死亡。某些参数（如图像格式或缩放）在校准后不应更改。

需要在激光消融期间和之后进行监测，以深入了解发生了什么。激光消融正在为褐藻发育研究的新发现铺平道路，并更深入地了解不同代谢物或其细胞成分的相互作用。