פרוטוקול זה הוא פרוטוקול האבלציה המלא הראשון בלייזר על עובר אצות ים מוקדם. ההליך מציע גישה אמינה לחקר גורל התאים והאינטראקציה שלהם במהלך יצירת עוברים באצות חומות. אבלציה מקומית בלייזר תאי מאפשרת אבלציה טמפורלית ומיוחדת עם רמה גבוהה של דיוק ורקמות על התאים.
גישה זו היא שיטה מבטיחה לחקר גורלם של תאים ואינטראקציה בעובר המוקדם של אצות חומות. ניתן ליישם אותו על מערכות אצות אחרות עם שינויים מעטים. התחל על ידי הדמיה של כל צלחת פטרי כדי לאתר את העוברים לבחירה במהלך שלב האבלציה ולעקוב אחר ההתפתחות הבאה של העוברים שנבחרו.
התחל את סריקת האריחים. רשום את המיקום של ארבע הנקודות הקרדינליות של צלחת פטרי. הזן את הפרמטרים כפי שהוגדרו בכתב היד של הטקסט וקבל תמונות מועברות או פלואורסצנטיות של כל צלחת פטרי ברזולוציה נמוכה.
שמור את תמונת סריקת האריחים והשאר אותה פתוחה בחלון התוכנה לרכישת תמונה. שנה את המטרה מבלי להסיר את צלחת הפטרי. מצא עוברים בעלי עניין בסריקה.
כדי לכייל את הלייזר, פתח את דרייבר הלייזר ואת חבילת התוכנה לרכישת תמונה. לאחר מכן אתחל את נתיב הלייזר. סנכרן את שתי חבילות התוכנה על-ידי לחיצה על התחלת הרכישה בחבילת התוכנה של מנהל ההתקן בלייזר.
הגדר את הפרמטרים עבור אבלציה בלייזר ולחץ על בשידור חי. בחרו אזור ריק בצלחת והורידו את מפלס הבמה ל-20 מיקרומטרים מתחת לפני השטח העליונים של צלחת הפטרי כדי להתמקד בתחתית הכוס. כדי למצוא אזור עניין על ידי לחיצה על כפתור בחר AOI ולחיצה על קצות התמונה בחבילת התוכנה לנהג לייזר UV.
לחץ על כיול התחל ובחר כיול ידני כדי להגדיר את מסלולי לייזר האבלציה ולייזר ההדמיה. ודאו שכל התריסים פתוחים. בחר עוצמת לייזר גבוהה מספיק כדי לראות נקודה שחורה במרכז התמונה החיה המתאימה לחור בהחלקת כיסוי הזכוכית.
לחץ על הנקודה השחורה המרכזית עם סמן העכבר ובחר 18 נקודות נוספות המוצעות על ידי התוכנה כדי להשלים את הליך היישור. לחץ על מצב הלחיצה והאש. בדקו את הכיול באותה החלקת כיסוי ולחצו על שכבת הזכוכית שבה נראית פגיעת הלייזר.
בחר עובר בעל עניין בסריקת האריחים והזז את הבמה על ידי לחיצה עליו. התחל את סדרת הזמן. בדוק את הפרמטרים של קיטועי הזמן בשידור חי והתאם במידת הצורך.
התחל הקלטה של קיטועי זמן בתוכנת רכישת התמונה במהירות המרבית. התאם את הזום כדי להתמקד באזור העניין ולדמיין את העובר כולו. כדי לעקוב אחר העובר במהלך הקלטת אבלציה, לחץ על הכפתור, לרכוש את התמונה האחרונה.
הגדר את הפרמטרים ל-45% שידור לייזר המתאים למקסימום של 40 מיקרו-וואט ומשך זמן דופק של אלפית השנייה. החל את ההקרנה המזיקה על תאי העובר המעניינים על ידי שימוש בתוכנת הלחיצה והאש של מנהל ההתקן בלייזר. תחת 688 ננומטרים, עקוב אחר פליטת הכלורופלסטים האוטו-פלואורסצנטיים מהציטופלסמה.
אם תוכן התא נשאר בתא, השתמש שוב בפונקציית הלחיצה והאש כדי להגדיל את גודל הפרצה בתא. חזור על תהליך זה עד שרוב תוכן התא ישוחרר, תוך שמירה על מספר הצילומים למינימום. יש להפסיק את רישום חלוף הזמן לאחר שהעובר התייצב ולא ניתן לזהות תנועה בין-תאית נוספת.
עדכן את ההערה בתמונת סריקת האריחים, החלף את סריקת האריחים הקיימת ושמור את התמונה. קבע את שיעור ההישרדות על ידי ניטור מספר העוברים המתפתחים לאחר אבלציה בלייזר והשווה אותם לאלה שמתים. קבעו את עיכוב הגדילה על ידי מדידת אורך העוברים הזרומים בלייזר מדי יום והשוואתו לעוברים שלמים.
מצא את הנזק הסמוך על ידי ניטור התגובה של תאים הסמוכים לתאים האבלים. תאים ממוקדים בעלי עניין היו התא האפיקלי ביותר, התא הבסיסי ביותר, והתאים החציוניים. לאחר סריקת אריחים של כל צלחת הפטרי, זוהה עובר בעל עניין כמועמד מתאים לירי בלייזר.
התא שחרר את תכולתו כאשר נורה עם קרן לייזר UV דופק בהספק של 45%, בעוד שהתא הסמוך לתאים המוקרנים התרחב לתוך החלל הבין-תאי. מיקום העוברים המוקרנים נרשם כל 24 שעות במשך 10 ימים. רוב העוברים המוקרנים המשיכו להתפתח אך הראו שינוי בגדילה.
לעומת זאת, עוברים שנבדקו עם פרמטרים אחרים של לייזר הראו במהירות סימנים של עקה חמורה כמו הלבנת תאים, דהייה או שינויי צורה. כמעט כל העוברים שנורו בדרך זו מתו תוך חמישה ימים לאחר הניסוי. אין לשנות פרמטרים מסוימים, כגון תבנית תמונה או זום לאחר הכיול.
ניטור במהלך ואחרי אבלציה בלייזר נדרש כדי לקבל תובנה לגבי מה שקרה. אבלציה בלייזר סוללת את הדרך לתגליות חדשות במחקר התפתחותי של אצות חומות ולהבנה מעמיקה יותר של אינטראקציות של מטבוליטים או רכיבים שונים של התאים שלהן.
