هذا البروتوكول هو أول بروتوكول استئصال كامل بالليزر على جنين عشب البحر المبكر. يوفر الإجراء نهجا موثوقا به في التحقيق في مصير الخلية والتفاعل أثناء التكوين الجنيني في الطحالب البنية. يسمح الاستئصال بالليزر الخلوي المحلي بالاستئصال الزمني والخاص بمستوى عال من الدقة والأنسجة على الخلايا.
هذا النهج هو طريقة واعدة لدراسة مصائر الخلايا والتفاعل في الجنين المبكر للطحالب البنية. يمكن تطبيقه على أنظمة الطحالب الأخرى مع تغييرات قليلة. ابدأ بتصوير طبق بتري بأكمله لتحديد موقع الأجنة للاختيار أثناء خطوة الاستئصال ومراقبة التطور اللاحق للأجنة المختارة.
ابدأ فحص البلاط. سجل موضع النقاط الأساسية الأربع لطبق بيتري. أدخل المعلمات كما هو محدد في مخطوطة النص واحصل على صور مرسلة أو فلورية لطبق بتري بأكمله بدقة منخفضة.
احفظ صورة المسح الضوئي للتجانب واجعلها مفتوحة في نافذة برنامج الحصول على الصور. تغيير الهدف دون إزالة طبق بيتري. ابحث عن الأجنة ذات الأهمية في الفحص.
لمعايرة الليزر، افتح برنامج تشغيل الليزر وحزمة برامج الحصول على الصور. ثم تهيئة مسار الليزر. قم بمزامنة كلتا حزمتي البرامج بالنقر فوق بدء الاستحواذ في حزمة برامج تشغيل الليزر.
قم بإعداد المعلمات للاستئصال بالليزر وانقر على البث المباشر. حدد منطقة فارغة على الطبق واخفض مستوى المرحلة إلى 20 ميكرومتر تحت السطح العلوي لطبق بتري للتركيز على الجزء السفلي الزجاجي. للعثور على مجال اهتمام من خلال النقر على زر اختيار AOI والنقر على حواف الصورة في حزمة برامج تشغيل الليزر فوق البنفسجي.
انقر فوق بدء المعايرة وحدد المعايرة اليدوية لتعيين مسارات ليزر الاستئصال والتصوير بالليزر. تأكد من أن جميع المصاريع مفتوحة. حدد طاقة ليزر عالية بما يكفي لرؤية نقطة سوداء في وسط الصورة الحية المقابلة للثقب الموجود في انزلاق الغطاء الزجاجي.
انقر فوق النقطة السوداء المركزية باستخدام مؤشر الماوس وحدد 18 نقطة إضافية يقترحها البرنامج لإكمال إجراء المحاذاة. انقر على وضع النقر والنار. تحقق من المعايرة على نفس شريحة الغطاء وانقر على الطبقة الزجاجية حيث يكون تأثير الليزر مرئيا.
حدد جنينا ذا أهمية في مسح البلاط وحرك المرحلة بالنقر فوقه. ابدأ السلسلة الزمنية. اختبار معلمات الفاصل الزمني في البث المباشر وضبطها إذا لزم الأمر.
ابدأ تسجيل الفاصل الزمني في برنامج الحصول على الصور بأقصى سرعة. اضبط التكبير/التصغير للتركيز على مجال الاهتمام وتصور الجنين بأكمله. لمتابعة الجنين أثناء تسجيل الاستئصال ، انقر فوق الزر ، واحصل على أحدث صورة.
اضبط المعلمات على إرسال ليزر بنسبة 45٪ تتوافق مع 40 ميكروواط كحد أقصى ومدة زمنية واحدة للنبض بالمللي ثانية. تطبيق التشعيع الضار على الخلايا الجنينية ذات الأهمية باستخدام برنامج تشغيل الليزر انقر ووظيفة النار. تحت 688 نانومتر ، راقب طرد البلاستيدات الخضراء ذاتية الفلورسنت من السيتوبلازم.
إذا بقيت محتويات الخلية في الخلية، فاستخدم وظيفة النقر وإطلاق النار مرة أخرى لزيادة حجم الخرق في الخلية. كرر هذه العملية حتى يتم تحرير معظم محتويات الخلية، مع الحفاظ على عدد اللقطات إلى الحد الأدنى. أوقف تسجيل الفاصل الزمني بعد استقرار الجنين وعدم اكتشاف أي حركة أخرى بين الخلايا.
قم بتحديث التعليق التوضيحي على صورة مسح التجانب ضوئيا، والكتابة فوق فحص التجانب الموجود، وحفظ الصورة. تحديد معدل البقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة عدد الأجنة التي تتطور بعد الاستئصال بالليزر ومقارنتها بتلك التي تموت. تحديد تأخر النمو عن طريق قياس طول الأجنة الملتقطة بالليزر كل يوم ومقارنتها بالأجنة السليمة.
ابحث عن الضرر المجاور من خلال مراقبة تفاعل الخلايا المجاورة للخلايا الممزقة. كانت الخلايا المستهدفة ذات الأهمية هي الخلية الأكثر قمية ، والخلايا القاعدية الأكثر ، والخلايا المتوسطة. بعد مسح البلاط لطبق بتري بأكمله ، تم تحديد جنين مثير للاهتمام كمرشح مناسب للتصوير بالليزر.
أطلقت الخلية محتوياتها عند إطلاقها بشعاع ليزر نبضي بالأشعة فوق البنفسجية بقوة 45٪ ، في حين توسعت الخلية المجاورة للخلايا المشععة في الفضاء بين الخلايا. تم تسجيل موضع الأجنة المشععة كل 24 ساعة لمدة 10 أيام. استمرت معظم الأجنة المشععة في التطور ولكنها أظهرت تغييرا في النمو.
في المقابل، سرعان ما أظهرت الأجنة التي تم اختبارها باستخدام معلمات الليزر الأخرى علامات الإجهاد الشديد مثل تبييض الخلايا أو تلاشيها أو تغيير شكلها. تقريبا جميع الأجنة التي تم إطلاق النار عليها بهذه الطريقة ماتت في غضون خمسة أيام بعد التجربة. يجب عدم تغيير بعض المعلمات، مثل تنسيق الصورة أو التكبير/التصغير بعد المعايرة.
مطلوب مراقبة أثناء وبعد الاستئصال بالليزر للحصول على نظرة ثاقبة على ما حدث. يمهد الاستئصال بالليزر الطريق لاكتشافات جديدة في الدراسة التنموية للطحالب البنية وفهم أكثر عمقا لتفاعلات المستقلبات المختلفة أو مكونات خلاياها.
