이 프로토콜은 초기 다시마 배아에 대한 최초의 완전한 레이저 절제 프로토콜입니다. 이 절차는 갈조류에서 배아 발생 중 세포 운명과 상호 작용을 조사하는 데 신뢰할 수있는 접근법을 제공합니다. 국소 세포 레이저 절제술은 세포에 높은 수준의 정밀도와 조직으로 시간적 및 특수 절제를 허용합니다.
이 접근법은 갈조류의 초기 배아에서 세포 운명과 상호 작용을 연구하는 유망한 방법입니다. 그것은 거의 변화없이 다른 조류 시스템에 적용될 수 있습니다. 먼저 전체 페트리 접시를 이미징하여 절제 단계 동안 선택을 위한 배아를 찾고 선택된 배아의 후속 발달을 모니터링한다.
타일 스캔을 시작합니다. 페트리 접시의 네 가지 기본 포인트의 위치를 기록하십시오. 텍스트 원고에 정의 된대로 매개 변수를 입력하고 낮은 해상도로 전체 Petri 접시의 전송 또는 형광 이미지를 획득하십시오.
타일 스캔 이미지를 저장하고 이미지 획득 소프트웨어 창에서 열린 상태로 유지합니다. 페트리 접시를 제거하지 않고 목표를 변경하십시오. 스캔에서 관심있는 배아를 찾으십시오.
레이저를 보정하려면 레이저 드라이버와 이미지 수집 소프트웨어 패키지를 엽니다. 그런 다음 레이저 경로를 초기화합니다. 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 획득 시작을 클릭하여 두 소프트웨어 패키지를 동기화합니다.
레이저 절제를위한 매개 변수를 설정하고 라이브를 클릭하십시오. 접시에서 빈 영역을 선택하고 무대 레벨을 페트리 접시의 윗면 아래 20 마이크로 미터로 낮추어 유리 바닥에 초점을 맞 춥니 다. AOI 선택 버튼을 클릭하고 UV 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 이미지의 가장자리를 클릭하여 관심 영역을 찾으려면
교정 시작을 클릭하고 수동 교정을 선택하여 절제 레이저 및 이미징 레이저 궤적을 설정합니다. 모든 셔터가 열려 있는지 확인합니다. 유리 커버 슬립의 구멍에 해당하는 라이브 이미지의 중앙에 검은 점을 볼 수 있을 만큼 충분히 높은 레이저 파워를 선택하십시오.
마우스 커서가있는 중앙 검은 점을 클릭하고 소프트웨어에서 제안한 18 개의 추가 점을 선택하여 정렬 절차를 완료하십시오. 클릭 및 화재 모드를 클릭하십시오. 동일한 커버 슬립에서 교정을 확인하고 레이저 충격이 보이는 유리 층을 클릭하십시오.
타일 스캔에서 관심있는 배아를 선택하고 클릭하여 단계를 이동하십시오. 시계열을 시작합니다. 라이브에서 시간 경과 매개 변수를 테스트하고 필요한 경우 조정하십시오.
최대 속도로 이미지 수집 소프트웨어에서 타임랩스 레코딩을 시작합니다. 확대/축소를 조정하여 관심 영역에 초점을 맞추고 전체 배아를 시각화합니다. 절제 기록 중에 배아를 따라 가려면 버튼을 클릭하고 최신 이미지를 얻으십시오.
파라미터를 최대 40마이크로와트 및 1밀리초의 펄스 지속 시간에 해당하는 45%레이저 전송으로 설정하십시오. 레이저 드라이버 소프트웨어를 사용하여 관심있는 배아 세포에 대한 손상 조사를 적용 클릭 및 화재 기능. 688 나노미터 하에서, 세포질로부터 자가형광 엽록체 배출을 모니터링한다.
셀 내용이 셀에 남아 있으면 클릭 및 실행 기능을 한 번 더 사용하여 셀의 위반 크기를 늘립니다. 대부분의 셀 내용이 해제될 때까지 이 과정을 반복하여 샷 수를 최소한으로 유지합니다. 배아가 안정화 된 후 시간 경과 기록을 중단하고 더 이상의 세포 간 이동을 감지 할 수 없습니다.
타일 스캔 이미지의 주석을 업데이트하고, 기존 타일 스캔을 덮어쓰고, 이미지를 저장합니다. 레이저 절제 후 발생하는 배아의 수를 모니터링하여 생존율을 결정하고 죽는 배아와 비교하십시오. 매일 레이저 샷 배아의 길이를 측정하고 손상되지 않은 배아와 비교하여 성장 지연을 결정하십시오.
절제된 세포에 인접한 세포의 반응을 모니터링함으로써 인접한 손상을 찾아낸다. 관심있는 표적 세포는 가장 정점 세포, 가장 기저 세포, 및 중앙값 세포였다. 전체 페트리 접시를 타일로 스캔 한 후, 관심있는 배아가 레이저 촬영에 적합한 후보로 확인되었습니다.
이 셀은 펄스 UV 레이저 빔으로 45% 파워로 촬영할 때 내용물을 방출했고, 조사된 셀에 인접한 셀은 세포간 공간으로 확장되었습니다. 조사된 배아의 위치는 10일 동안 24시간마다 기록되었다. 조사된 배아의 대부분은 계속 발달했지만 성장 변화를 보였다.
대조적으로, 다른 레이저 매개 변수로 테스트 된 배아는 세포 표백, 퇴색 또는 모양 변화와 같은 심각한 스트레스의 징후를 신속하게 보여주었습니다. 이런 식으로 촬영한 거의 모든 배아는 실험 후 닷새 만에 죽었다. 이미지 형식이나 확대/축소와 같은 일부 매개 변수는 보정 후에 변경해서는 안 됩니다.
레이저 절제 중 및 이후 모니터링은 무슨 일이 일어 났는지에 대한 통찰력을 가져야합니다. 레이저 절제술은 갈조류의 발달 연구와 다른 대사 산물 또는 세포 구성 요소의 상호 작용에 대한보다 심오한 이해에서 새로운 발견의 길을 열어주고 있습니다.
