Bu protokol erken kelp embriyosundaki ilk tam lazer ablasyon protokolüdür. Prosedür, kahverengi alglerde embriyogenez sırasında hücre kaderini ve etkileşimini araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır. Lokal hücresel lazer ablasyon, hücreler üzerinde yüksek hassasiyet ve doku seviyesi ile temporal ve özel ablasyona izin verir.
Bu yaklaşım, kahverengi alglerin erken embriyosundaki hücre kaderlerini ve etkileşimini incelemek için umut verici bir yöntemdir. Birkaç değişiklikle diğer alg sistemlerine uygulanabilir. Ablasyon adımı sırasında seçilecek embriyoları bulmak ve seçilen embriyoların sonraki gelişimini izlemek için tüm Petri kabını görüntüleyerek başlayın.
Kutucuk taramasını başlatın. Petri kabının dört kardinal noktasının konumunu kaydedin. Metin yazısında tanımlanan parametreleri girin ve tüm Petri kabının iletilen veya floresan görüntülerini düşük çözünürlükte elde edin.
Döşeme tarama görüntüsünü kaydedin ve görüntü alma yazılımı penceresinde açık tutun. Petri kabını çıkarmadan hedefi değiştirin. Taramada ilgilendiğiniz embriyoları bulun.
Lazeri kalibre etmek için, lazer sürücüsü ve görüntü alma yazılım paketini açın. Ardından lazer yolunu başlatın. Lazer sürücüsü yazılım paketinde edinimi başlat'a tıklayarak her iki yazılım paketini de senkronize edin.
Lazer ablasyon parametrelerini ayarlayın ve canlı üzerine tıklayın. Çanak üzerinde boş bir alan seçin ve cam tabana odaklanmak için sahne seviyesini Petri kabının üst yüzeyinin 20 mikrometre altına indirin. AOI seç düğmesine tıklayarak ve UV lazer sürücüsü yazılım paketindeki görüntünün kenarlarına tıklayarak ilgi çekici bir alan bulmak için.
Kalibrasyonu başlat'a tıklayın ve ablasyon lazeri ve görüntüleme lazer yörüngelerini ayarlamak için manuel kalibrasyonu seçin. Tüm kepenklerin açık olduğundan emin olun. Canlı görüntünün ortasında, cam kapak kaymasındaki deliğe karşılık gelen siyah bir nokta görecek kadar yüksek bir lazer gücü seçin.
Fare imleci ile merkezi siyah noktaya tıklayın ve hizalama prosedürünü tamamlamak için yazılım tarafından önerilen 18 ek noktayı seçin. Tıklama ve ateş moduna tıklayın. Aynı kapak kapağındaki kalibrasyonu kontrol edin ve lazer etkisinin görülebildiği cam tabakaya tıklayın.
Fayans taramasında ilgilendiğiniz bir embriyoyu seçin ve üzerine tıklayarak sahneyi hareket ettirin. Zaman serisini başlatın. Zaman atlamalı parametreleri canlı olarak test edin ve gerekirse ayarlayın.
Görüntü alma yazılımında maksimum hızda hızlandırılmış bir kayıt başlatın. İlgi alanına odaklanmak ve tüm embriyoyu görselleştirmek için yakınlaştırmayı ayarlayın. Ablasyonun kaydedilmesi sırasında embriyoyu takip etmek için, düğmeye tıklayın, en son görüntüyü elde edin.
Parametreleri, maksimum 40 mikrowatt ve bir milisaniyelik darbe süresi süresine karşılık gelen% 45 lazer iletimine ayarlayın. Lazer sürücü yazılımı tıklama ve ateş fonksiyonunu kullanarak ilgili embriyo hücrelerine zararlı ışınlamayı uygulayın. 688 nanometrenin altında, sitoplazmadan otofloresan kloroplastların atılmasını izleyin.
Hücre içeriği hücrede kalırsa, hücredeki ihlalin boyutunu artırmak için tıklatma ve tetikleme işlevini bir kez daha kullanın. Hücre içeriğinin çoğu serbest bırakılana kadar bu işlemi tekrarlayın ve çekim sayısını minimumda tutun. Embriyo stabilize olduktan sonra hızlandırılmış kaydı durdurun ve daha fazla hücreler arası hareket tespit edilemez.
Kutucuk tarama görüntüsündeki ek açıklamayı güncelleştirin, varolan kutucuk taramasının üzerine yazın ve görüntüyü kaydedin. Lazer ablasyondan sonra gelişen embriyo sayısını izleyerek hayatta kalma oranını belirleyin ve bunları ölenlerle karşılaştırın. Her gün lazer atışı embriyolarının uzunluğunu ölçerek ve sağlam embriyolarla karşılaştırarak büyüme gecikmesini belirleyin.
Ablatlanmış hücrelere bitişik hücrelerin reaksiyonunu izleyerek bitişik hasarı bulun. İlgilenilen hedeflenen hücreler en apikal hücre, en bazal hücre ve medyan hücrelerdi. Tüm Petri kabının karo taramasından sonra, ilgilenilen bir embriyo lazer çekimi için uygun bir aday olarak tanımlandı.
Hücre,% 45 güçte bir darbeli UV lazer ışını ile vurulduğunda içeriğini serbest bırakırken, ışınlanmış hücrelere bitişik bir hücrenin hücreler arası boşluğa genişlemesi. Işınlanan embriyoların pozisyonu 10 gün boyunca her 24 saatte bir kaydedildi. Işınlanmış embriyoların çoğu gelişmeye devam etti, ancak büyüme değişikliği gösterdi.
Buna karşılık, diğer lazer parametreleriyle test edilen embriyolar, hücre ağartması, solma veya şekil değişiklikleri gibi ciddi stres belirtilerini hızla gösterdi. Bu şekilde vurulan embriyoların neredeyse tamamı deneyden sonraki beş gün içinde öldü. Görüntü formatı veya yakınlaştırma gibi bazı parametreler kalibrasyondan sonra değiştirilmemelidir.
Lazer ablasyon sırasında ve sonrasında izleme, neler olduğuna dair fikir sahibi olmak için gereklidir. Lazer ablasyon, kahverengi alglerin gelişimsel çalışmasında yeni keşiflere ve farklı metabolitlerin veya hücrelerinin bileşenlerinin etkileşimlerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına yol açmaktadır.
