Ce protocole est le premier protocole complet d’ablation au laser sur embryon de varech précoce. La procédure offre une approche fiable pour étudier le devenir cellulaire et l’interaction au cours de l’embryogenèse chez les algues brunes. L’ablation cellulaire locale au laser permet une ablation temporelle et spéciale avec un haut niveau de précision et de tissu sur les cellules.
Cette approche est une méthode prometteuse pour étudier le destin cellulaire et l’interaction dans l’embryon précoce d’algues brunes. Il peut être appliqué à d’autres systèmes d’algues avec peu de changements. Commencez par imager l’ensemble de la boîte de Pétri pour localiser les embryons à sélectionner pendant l’étape d’ablation et surveiller le développement ultérieur des embryons sélectionnés.
Lancez l’analyse des vignettes. Notez la position des quatre points cardinaux de la boîte de Pétri. Entrez les paramètres définis dans le manuscrit textuel et acquérez des images transmises ou fluorescentes de l’ensemble de la boîte de Pétri à basse résolution.
Enregistrez l’image de numérisation par vignette et gardez-la ouverte dans la fenêtre du logiciel d’acquisition d’image. Changez l’objectif sans retirer la boîte de Pétri. Trouvez des embryons d’intérêt sur le scan.
Pour calibrer le laser, ouvrez le pilote laser et le progiciel d’acquisition d’images. Ensuite, initialisez le chemin laser. Synchronisez les deux progiciels en cliquant sur Démarrer l’acquisition dans le progiciel du pilote laser.
Configurez les paramètres de l’ablation au laser et cliquez sur live. Sélectionnez une zone vide sur la boîte et abaissez le niveau de la scène à 20 micromètres sous la surface supérieure de la boîte de Pétri pour vous concentrer sur le fond en verre. Pour trouver une zone d’intérêt en cliquant sur le bouton choisir AOI et en cliquant sur les bords de l’image dans le progiciel du pilote laser UV.
Cliquez sur Démarrer l’étalonnage et sélectionnez l’étalonnage manuel pour définir les trajectoires du laser d’ablation et du laser d’imagerie. Assurez-vous que tous les volets sont ouverts. Sélectionnez une puissance laser suffisamment élevée pour voir un point noir au centre de l’image en direct correspondant au trou dans le glissement du couvercle en verre.
Cliquez sur le point noir central avec le curseur de la souris et sélectionnez 18 points supplémentaires proposés par le logiciel pour compléter la procédure d’alignement. Cliquez sur le mode clic et tir. Vérifiez l’étalonnage sur le même couvercle et cliquez sur la couche de verre où l’impact laser est visible.
Sélectionnez un embryon d’intérêt sur le scan de tuiles et déplacez la scène en cliquant dessus. Démarrez la série chronologique. Testez les paramètres de laps de temps en direct et ajustez-les si nécessaire.
Démarrez un enregistrement en accéléré dans le logiciel d’acquisition d’images à la vitesse maximale. Ajustez le zoom pour vous concentrer sur la zone d’intérêt et visualisez l’embryon entier. Pour suivre l’embryon pendant l’enregistrement de l’ablation, cliquez sur le bouton, acquérez la dernière image.
Réglez les paramètres sur une transmission laser de 45%, ce qui correspond à un maximum de 40 microwatts et à une durée d’impulsion d’une milliseconde. Appliquez l’irradiation dommageable sur les cellules embryonnaires d’intérêt à l’aide de la fonction de clic et de tir du logiciel du pilote laser. Sous 688 nanomètres, surveillez l’éjection des chloroplastes autofluorescents du cytoplasme.
Si le contenu de la cellule reste dans la cellule, utilisez à nouveau la fonction de clic et de tir pour augmenter la taille de la brèche dans la cellule. Répétez ce processus jusqu’à ce que la plupart du contenu de la cellule soit libéré, en maintenant le nombre de tirs au minimum. Arrêtez l’enregistrement en accéléré une fois que l’embryon s’est stabilisé et qu’aucun autre mouvement intercellulaire ne peut être détecté.
Mettez à jour l’annotation sur l’image de numérisation de vignette, remplacez la numérisation de vignette existante et enregistrez l’image. Déterminez le taux de survie en surveillant le nombre d’embryons qui se développent après l’ablation au laser et comparez-les à ceux qui meurent. Déterminez le retard de croissance en mesurant la longueur des embryons injectés au laser chaque jour et en la comparant à des embryons intacts.
Trouvez les dommages adjacents en surveillant la réaction des cellules adjacentes aux cellules ablées. Les cellules d’intérêt ciblées étaient les cellules les plus apicales, les cellules les plus basales et les cellules médianes. Après avoir scanné l’ensemble de la boîte de Pétri, un embryon d’intérêt a été identifié comme un candidat approprié pour la prise de vue au laser.
La cellule a libéré son contenu lorsqu’elle a été filmée avec un faisceau laser UV à impulsions à 45% de puissance, tandis que la cellule adjacente aux cellules irradiées s’est étendue dans l’espace intercellulaire. La position des embryons irradiés a été enregistrée toutes les 24 heures pendant 10 jours. La plupart des embryons irradiés ont continué à se développer, mais ont montré une altération de la croissance.
En revanche, les embryons testés avec d’autres paramètres laser ont rapidement montré des signes de stress sévère tels que le blanchiment cellulaire, la décoloration ou les changements de forme. Presque tous les embryons ainsi abattus sont morts dans les cinq jours suivant l’expérience. Certains paramètres, tels que le format d’image ou le zoom, ne doivent pas être modifiés après l’étalonnage.
Une surveillance pendant et après l’ablation au laser est nécessaire pour avoir un aperçu de ce qui s’est passé. L’ablation au laser ouvre la voie à de nouvelles découvertes dans l’étude du développement des algues brunes et à une compréhension plus profonde des interactions de différents métabolites ou composants de leurs cellules.
