Este protocolo é o primeiro protocolo completo de ablação a laser no embrião de algas precoces. O procedimento oferece uma abordagem confiável na investigação do destino celular e interação durante a embriogênese em algas marrons. A ablação a laser celular local permite a ablação temporal e especial com um alto nível de precisão e tecido nas células.
Esta abordagem é um método promissor para estudar destinos celulares e interação no embrião inicial de algas marrons. Pode ser aplicado a outros sistemas de algas com poucas alterações. Comece por imagens de toda a placa de Petri para localizar os embriões para seleção durante a etapa de ablação e monitorar o desenvolvimento subsequente dos embriões selecionados.
Inicie a varredura de ladrilhos. Regissua a posição dos quatro pontos cardeais da placa de Petri. Digite os parâmetros conforme definido no manuscrito do texto e adquira imagens transmitidas ou fluorescentes de toda a placa de Petri em baixa resolução.
Salve a imagem de varredura de ladrilhos e mantenha-a aberta na janela do software de aquisição de imagens. Mude o objetivo sem remover a placa de Petri. Encontre embriões de interesse na varredura.
Para calibrar o laser, abra o driver laser e o pacote de software de aquisição de imagens. Em seguida, inicialize o caminho do laser. Sincronize ambos os pacotes de software clicando na aquisição inicial no pacote de software do driver laser.
Configure os parâmetros para ablação a laser e clique ao vivo. Selecione uma área vazia na placa e baixe o nível do palco para 20 micrômetros abaixo da superfície superior da placa de Petri para se concentrar no fundo do vidro. Para encontrar uma área de interesse, clique no botão escolher AOI e clicar nas bordas da imagem no pacote de software do driver laser UV.
Clique na calibração inicial e selecione calibração manual para definir as trajetórias de laser de ablação e imagem. Certifique-se de que todas as persianas estão abertas. Selecione um poder laser alto o suficiente para ver um ponto negro no centro da imagem ao vivo correspondente ao orifício no deslizamento da tampa de vidro.
Clique no ponto preto central com o cursor do mouse e selecione 18 pontos adicionais propostos pelo software para completar o procedimento de alinhamento. Clique no modo clique e no modo de fogo. Verifique a calibração no mesmo deslizamento de tampa e clique na camada de vidro onde o impacto do laser é visível.
Selecione um embrião de interesse na varredura de ladrilhos e mova o palco clicando nele. Comece a série temporal. Teste parâmetros de lapso de tempo ao vivo e ajuste se necessário.
Inicie uma gravação de lapso de tempo no software de aquisição de imagens na velocidade máxima. Ajuste o zoom para focar na área de interesse e visualize todo o embrião. Para seguir o embrião durante a gravação da ablação, clique no botão e adquira a imagem mais recente.
Defina os parâmetros para transmissão a laser de 45% correspondente a um máximo de 40 microwatts e uma duração de tempo de pulso de milissegundo. Aplique a irradiação prejudicial nas células de embrião de interesse usando o clique do software do driver laser e a função de fogo. Sob 688 nanômetros, monitore a ejeção de cloroplastos autofluorescentes a partir do citoplasma.
Se o conteúdo da célula permanecer na célula, use a função clique e fogo mais uma vez para aumentar o tamanho da brecha na célula. Repita este processo até que a maioria dos conteúdos do celular sejam liberados, mantendo o número de fotos ao mínimo. Pare a gravação do lapso de tempo após o embrião ter estabilizado e nenhum movimento intercelular adicional pode ser detectado.
Atualize a anotação na imagem de varredura de ladrilhos, substitua a digitalização de ladrilhos existente e salve a imagem. Determine a taxa de sobrevivência monitorando o número de embriões que se desenvolvem após a ablação a laser e compare-os com aqueles que morrem. Determine o atraso de crescimento medindo o comprimento dos embriões de tiro a laser todos os dias e comparando-o com embriões intactos.
Encontre o dano adjacente monitorando a reação das células adjacentes às células abladas. As células-alvo de interesse eram a célula mais apical, a célula mais basal, e as células medianas. Depois de escanear toda a placa de Petri, um embrião de interesse foi identificado como um candidato adequado para tiro a laser.
A célula liberou seu conteúdo quando filmada com um raio laser UV de pulso com 45% de potência, enquanto uma célula adjacente às células irradiadas se expandiu para o espaço intercelular. A posição dos embriões irradiados foi registrada a cada 24 horas durante 10 dias. A maioria dos embriões irradiados continuou a se desenvolver, mas apresentou alteração de crescimento.
Em contraste, embriões testados com outros parâmetros de laser rapidamente mostraram sinais de estresse severo, como branqueamento celular, desbotamento ou mudanças de forma. Quase todos os embriões baleados desta forma morreram cinco dias após o experimento. Alguns parâmetros, como formato de imagem ou zoom, não devem ser alterados após a calibração.
O monitoramento durante e após a ablação a laser é necessário para ter uma visão do que aconteceu. A ablação a laser está abrindo caminho para novas descobertas no estudo de desenvolvimento de algas marrons e compreensão mais profunda das interações de diferentes metabólitos ou componentes de suas células.
