Questo protocollo è il primo protocollo di ablazione laser completo sull'embrione precoce di alghe. La procedura offre un approccio affidabile per studiare il destino e l'interazione cellulare durante l'embriogenesi nelle alghe brune. L'ablazione laser cellulare locale consente l'ablazione temporale e speciale con un alto livello di precisione e tessuto sulle cellule.
Questo approccio è un metodo promettente per studiare il destino cellulare e l'interazione nell'embrione precoce delle alghe brune. Può essere applicato ad altri sistemi di alghe con poche modifiche. Inizia con l'imaging dell'intera capsula di Petri per localizzare gli embrioni per la selezione durante la fase di ablazione e monitorare il successivo sviluppo degli embrioni selezionati.
Avviare la scansione dei riquadri. Registrare la posizione dei quattro punti cardinali della capsula di Petri. Inserisci i parametri definiti nel manoscritto testuale e acquisisci immagini trasmesse o fluorescenti dell'intera capsula di Petri a bassa risoluzione.
Salvare l'immagine di scansione dei riquadri e tenerla aperta nella finestra del software di acquisizione delle immagini. Cambia l'obiettivo senza rimuovere la capsula di Petri. Trova gli embrioni di interesse sulla scansione.
Per calibrare il laser, aprire il driver laser e il pacchetto software di acquisizione delle immagini. Quindi inizializzare il percorso laser. Sincronizzare entrambi i pacchetti software facendo clic su Avvia acquisizione nel pacchetto software del driver laser.
Impostare i parametri per l'ablazione laser e fare clic su live. Selezionare un'area vuota sul piatto e abbassare il livello del palco a 20 micrometri sotto la superficie superiore della capsula di Petri per concentrarsi sul fondo di vetro. Per trovare un'area di interesse facendo clic sul pulsante scegli AOI e facendo clic sui bordi dell'immagine nel pacchetto software del driver laser UV.
Fare clic su Avvia calibrazione e selezionare la calibrazione manuale per impostare il laser di ablazione e le traiettorie laser di imaging. Assicurarsi che tutte le persiane siano aperte. Selezionare una potenza laser sufficientemente elevata da vedere un punto nero al centro dell'immagine dal vivo corrispondente al foro nella copertura di vetro.
Fare clic sul punto nero centrale con il cursore del mouse e selezionare 18 punti aggiuntivi proposti dal software per completare la procedura di allineamento. Fare clic sulla modalità clic e fuoco. Controllare la calibrazione sullo stesso coperchio e fare clic sullo strato di vetro in cui è visibile l'impatto laser.
Seleziona un embrione di interesse nella scansione delle tessere e sposta il palco facendo clic su di esso. Avviare la serie temporale. Testare i parametri di time lapse in tempo reale e regolarli se necessario.
Avviare una registrazione time lapse nel software di acquisizione delle immagini alla massima velocità. Regola lo zoom per mettere a fuoco l'area di interesse e visualizzare l'intero embrione. Per seguire l'embrione durante la registrazione dell'ablazione, fare clic sul pulsante, acquisire l'ultima immagine.
Impostare i parametri su 45% di trasmissione laser corrispondente a un massimo di 40 microwatt e un millisecondo di durata dell'impulso. Applicare l'irradiazione dannosa sulle cellule embrionali di interesse utilizzando la funzione click and fire del software del driver laser. Sotto i 688 nanometri, monitorare l'espulsione dei cloroplasti autofluorescenti dal citoplasma.
Se il contenuto della cella rimane nella cella, utilizzare nuovamente la funzione click and fire per aumentare le dimensioni della violazione nella cella. Ripeti questo processo fino a quando la maggior parte del contenuto della cella viene rilasciato, mantenendo il numero di scatti al minimo. Interrompere la registrazione del time lapse dopo che l'embrione si è stabilizzato e non è possibile rilevare ulteriori movimenti intercellulari.
Aggiornare l'annotazione sull'immagine di scansione dei riquadri, sovrascrivere l'analisi dei riquadri esistente e salvare l'immagine. Determinare il tasso di sopravvivenza monitorando il numero di embrioni che si sviluppano dopo l'ablazione laser e confrontarli con quelli che muoiono. Determinare il ritardo di crescita misurando la lunghezza degli embrioni sparati al laser ogni giorno e confrontandolo con embrioni intatti.
Trova il danno adiacente monitorando la reazione delle cellule adiacenti alle cellule ablate. Le cellule bersaglio di interesse erano la cellula più apicale, la cellula più basale e le cellule mediane. Dopo la scansione delle piastrelle dell'intera capsula di Petri, un embrione di interesse è stato identificato come candidato adatto per la ripresa laser.
La cellula ha rilasciato il suo contenuto quando è stata colpita con un raggio laser UV a impulsi al 45% di potenza, mentre una cellula adiacente alle cellule irradiate si è espansa nello spazio intercellulare. La posizione degli embrioni irradiati è stata registrata ogni 24 ore per 10 giorni. La maggior parte degli embrioni irradiati ha continuato a svilupparsi, ma ha mostrato alterazioni della crescita.
Al contrario, gli embrioni testati con altri parametri laser hanno mostrato rapidamente segni di grave stress come lo sbiancamento cellulare, lo sbiadimento o i cambiamenti di forma. Quasi tutti gli embrioni uccisi in questo modo sono morti entro cinque giorni dall'esperimento. Alcuni parametri, come il formato dell'immagine o lo zoom, non devono essere modificati dopo la calibrazione.
Il monitoraggio durante e dopo l'ablazione laser è necessario per avere informazioni su ciò che è accaduto. L'ablazione laser sta aprendo la strada a nuove scoperte nello studio dello sviluppo delle alghe brune e a una comprensione più profonda delle interazioni di diversi metaboliti o componenti delle loro cellule.
