Dieses Protokoll ist das erste vollständige Laserablationsprotokoll am frühen Seetang-Embryo. Das Verfahren bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung des Zellschicksals und der Interaktion während der Embryogenese in Braunalgen. Die lokale zelluläre Laserablation ermöglicht eine zeitliche und spezielle Ablation mit hoher Präzision und Gewebe auf Zellen.
Dieser Ansatz ist eine vielversprechende Methode, um Zellschicksale und Wechselwirkungen im frühen Embryo von Braunalgen zu untersuchen. Es kann mit wenigen Änderungen auf andere Algensysteme angewendet werden. Beginnen Sie mit der Abbildung der gesamten Petrischale, um die Embryonen für die Selektion während des Ablationsschritts zu lokalisieren und die nachfolgende Entwicklung der ausgewählten Embryonen zu überwachen.
Starten Sie den Kachelscan. Notieren Sie sich die Position der vier Himmelsrichtungen der Petrischale. Geben Sie die im Textmanuskript definierten Parameter ein und erfassen Sie durchgelassene oder fluoreszierende Bilder der gesamten Petrischale in niedriger Auflösung.
Speichern Sie das Kachelscanbild und lassen Sie es im Fenster der Bildaufnahmesoftware geöffnet. Ändern Sie das Ziel, ohne die Petrischale zu entfernen. Finden Sie Embryonen von Interesse auf dem Scan.
Um den Laser zu kalibrieren, öffnen Sie den Lasertreiber und das Softwarepaket für die Bildaufnahme. Initialisieren Sie dann den Laserpfad. Synchronisieren Sie beide Softwarepakete, indem Sie im Lasertreiber-Softwarepaket auf Erfassung starten klicken.
Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein und klicken Sie auf live. Wählen Sie einen leeren Bereich auf der Schale und senken Sie die Bühnenebene auf 20 Mikrometer unter die Oberseite der Petrischale, um sich auf den Glasboden zu konzentrieren. Um einen Interessenbereich zu finden, klicken Sie auf die Schaltfläche AOI auswählen und klicken Sie auf die Bildränder im UV-Lasertreiber-Softwarepaket.
Klicken Sie auf Kalibrierung starten und wählen Sie Manuelle Kalibrierung, um die Ablationslaser- und Bildgebungslasertrajektorien einzustellen. Stellen Sie sicher, dass alle Rollläden geöffnet sind. Wählen Sie eine Laserleistung, die hoch genug ist, um einen schwarzen Punkt in der Mitte des Livebildes zu sehen, der dem Loch im Glasdeckel entspricht.
Klicken Sie mit dem Mauszeiger auf den zentralen schwarzen Punkt und wählen Sie 18 zusätzliche Punkte aus, die von der Software vorgeschlagen werden, um den Ausrichtungsvorgang abzuschließen. Klicken Sie auf den Klick- und Feuermodus. Überprüfen Sie die Kalibrierung auf demselben Deckglas und klicken Sie auf die Glasschicht, auf der der Laseraufprall sichtbar ist.
Wählen Sie einen Embryo von Interesse auf dem Kachel-Scan aus und bewegen Sie das Stadium, indem Sie darauf klicken. Starten Sie die Zeitreihe. Testen Sie die Zeitrafferparameter live und passen Sie sie bei Bedarf an.
Starten Sie eine Zeitrafferaufnahme in der Bildaufnahmesoftware mit maximaler Geschwindigkeit. Passen Sie den Zoom an, um sich auf den interessierenden Bereich zu konzentrieren und den gesamten Embryo zu visualisieren. Um den Embryo während der Aufzeichnung der Ablation zu verfolgen, klicken Sie auf die Schaltfläche, um das neueste Bild aufzunehmen.
Stellen Sie die Parameter auf 45% Laserübertragung ein, was einem Maximum von 40 Mikrowatt und einer Pulszeitdauer von einer Millisekunde entspricht. Wenden Sie die schädliche Bestrahlung auf die interessierenden Embryozellen an, indem Sie die Klick- und Feuerfunktion der Lasertreibersoftware verwenden. Überwachen Sie unter 688 Nanometern den Ausstoß autofluoreszierender Chloroplasten aus dem Zytoplasma.
Wenn der Zellinhalt in der Zelle verbleibt, verwenden Sie die Klick- und Feuerfunktion erneut, um die Größe des Verstoßes in der Zelle zu erhöhen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Zellinhalts freigegeben ist, und halten Sie die Anzahl der Schüsse auf ein Minimum. Stoppen Sie die Zeitrafferaufzeichnung, nachdem sich der Embryo stabilisiert hat und keine weitere interzelluläre Bewegung festgestellt werden kann.
Aktualisieren Sie die Anmerkungen auf dem Kachelscanbild, überschreiben Sie den vorhandenen Kachelscan, und speichern Sie das Bild. Bestimmen Sie die Überlebensrate, indem Sie die Anzahl der Embryonen überwachen, die sich nach der Laserablation entwickeln, und vergleichen Sie sie mit denen, die sterben. Bestimmen Sie die Wachstumsverzögerung, indem Sie jeden Tag die Länge der lasergeschossenen Embryonen messen und mit intakten Embryonen vergleichen.
Finden Sie den angrenzenden Schaden, indem Sie die Reaktion von Zellen überwachen, die an die abgetragenen Zellen angrenzen. Zielzellen von Interesse waren die apikalste Zelle, die basalste Zelle und die medianen Zellen. Nach dem Scannen der gesamten Petrischale wurde ein interessanter Embryo als geeigneter Kandidat für das Laserschießen identifiziert.
Die Zelle setzte ihren Inhalt frei, wenn sie mit einem Puls-UV-Laserstrahl mit 45% Leistung aufgenommen wurde, während sich eine Zelle neben den bestrahlten Zellen in den Interzellularraum ausdehnte. Die Position der bestrahlten Embryonen wurde alle 24 Stunden für 10 Tage aufgezeichnet. Die meisten der bestrahlten Embryonen entwickelten sich weiter, zeigten aber eine Wachstumsveränderung.
Im Gegensatz dazu zeigten Embryonen, die mit anderen Laserparametern getestet wurden, schnell Anzeichen von starkem Stress wie Zellbleichen, Verblassen oder Formveränderungen. Fast alle auf diese Weise geschossenen Embryonen starben innerhalb von fünf Tagen nach dem Experiment. Einige Parameter wie Bildformat oder Zoom sollten nach der Kalibrierung nicht verändert werden.
Eine Überwachung während und nach der Laserablation ist erforderlich, um einen Einblick in das Geschehene zu erhalten. Die Laserablation ebnet den Weg für neue Entdeckungen in der Entwicklungsstudie von Braunalgen und ein tieferes Verständnis der Wechselwirkungen verschiedener Metaboliten oder Bestandteile ihrer Zellen.
