このプロトコルは、初期昆布胚に関する最初の完全なレーザーアブレーションプロトコルです。この手順は、褐藻類の胚発生中の細胞運命および相互作用を調査する上で信頼できるアプローチを提供する。局所細胞レーザーアブレーションは、細胞上の高いレベルの精度と組織で時間的および特別なアブレーションを可能にします。
このアプローチは、褐藻の初期胚における細胞運命および相互作用を研究するための有望な方法である。それはほとんど変化のない他の藻類系に適用することができます。アブレーションステップ中に選択のための胚を見つけるためにペトリ皿全体をイメージングすることから始め、選択された胚のその後の発達を監視する。
タイル スキャンを開始します。ペトリ皿の4つの基点の位置を記録する。テキスト原稿で定義されているパラメータを入力し、ペトリ皿全体の透過画像または蛍光画像を低解像度で取得します。
タイルスキャン画像を保存し、画像取得ソフトウェアウィンドウで開いたままにします。ペトリ皿を取り外さずに目的を変えます。スキャンで目的の胚を見つけます。
レーザーを較正するには、レーザードライバーと画像取得ソフトウェアパッケージを開きます。次に、レーザーパスを初期化します。レーザードライバソフトウェアパッケージの集録開始をクリックして、両方のソフトウェアパッケージを同期します。
レーザーアブレーションのパラメータを設定し、ライブをクリックします。皿の空いている部分を選択し、ステージレベルをペトリ皿の上面から20マイクロメートル下に下げて、ガラス底に焦点を合わせます。AOIボタンを選択し、UVレーザードライバソフトウェアパッケージ内の画像の端をクリックして、関心のある領域を見つけるには。
キャリブレーションの開始をクリックし、手動キャリブレーションを選択してアブレーションレーザーとイメージングレーザーの軌道を設定します。すべてのシャッターが開いていることを確認します。ガラスカバースリップの穴に対応するライブ画像の中央に黒い点が表示されるように、十分に高いレーザーパワーを選択します。
中央の黒い点をマウスカーソルでクリックし、ソフトウェアによって提案された18個の追加のドットを選択して、位置合わせ手順を完了します。クリックアンドファイアモードをクリックします。同じカバースリップでキャリブレーションを確認し、レーザー衝撃が見えるガラス層をクリックします。
タイルスキャンで目的の胚を選択し、それをクリックしてステージを移動します。時系列を開始します。ライブでタイムラプスパラメータをテストし、必要に応じて調整します。
最高速度で画像取得ソフトでタイムラプス記録を開始します。ズームを調整して関心領域に焦点を合わせ、胚全体を視覚化します。アブレーションの記録中に胚を追跡するには、ボタンをクリックして、最新の画像を取得します。
パラメータを、最大40マイクロワットと1ミリ秒のパルス時間に対応する45%レーザー伝送に設定します。レーザードライバーソフトウェアのクリックアンドファイア機能を使用して、目的の胚細胞に損傷照射を適用します。688ナノメートル下で、細胞質からの自己蛍光葉緑体放出をモニターする。
セルの内容がセルに残っている場合は、もう一度クリック アンド ファイア機能を使用して、セル内の違反のサイズを大きくします。ほとんどのセルの内容が解放されるまでこのプロセスを繰り返し、ショット数を最小限に抑えます。胚が安定し、それ以上の細胞間運動を検出できなくなった後に、タイムラプス記録を停止する。
タイル スキャン イメージの注釈を更新し、既存のタイル スキャンを上書きして、イメージを保存します。レーザーアブレーション後に発生する胚の数を監視して生存率を決定し、それらを死んだ胚と比較します。レーザーショット胚の長さを毎日測定し、それを無傷の胚と比較することによって、成長遅延を決定する。
アブレーションされた細胞に隣接する細胞の反応をモニターすることによって、隣接する損傷を見つける。関心のある標的細胞は、最も頂端細胞、最も基底細胞、および中央細胞であった。タイルがペトリ皿全体をスキャンした後、目的の胚がレーザー撮影に適した候補として同定された。
細胞は、45%のパワーでパルスUVレーザービームで撮影するとその内容物を放出し、照射された細胞に隣接する細胞は細胞間空間に拡大した。照射した胚の位置を10日間24時間毎に記録した。照射された胚のほとんどは発達を続けたが、成長変化を示した。
対照的に、他のレーザーパラメータで試験された胚は、細胞の漂白、退色、または形状変化などの重度のストレスの徴候を迅速に示した。このようにして撮影されたほとんどすべての胚は、実験後5日以内に死亡した。画像形式やズームなどの一部のパラメータは、キャリブレーション後に変更しないでください。
レーザーアブレーション中およびレーザーアブレーション後のモニタリングは、何が起こったのかについての洞察を得るために必要です。レーザーアブレーションは、褐藻の発生研究における新しい発見と、それらの細胞の異なる代謝産物または成分の相互作用のより深い理解への道を開いています。
