鉴于伤害感受器神经元分泌各种神经肽，并且NK细胞表达这些神经肽的受体，我们决定设计一种共培养方法来研究NK细胞和伤害感受器神经元之间的相互作用。这种还原论方法可用于研究伤害感受神经元如何控制NK细胞的抗肿瘤功能，并且研究NK细胞如何控制受损神经元的消除也可能很有趣。演示该程序的将是我实验室的前硕士生Ali Ahmadi。
为了开始自然杀伤或NK细胞分离和培养，将小鼠脾脏收集在含有500微升无菌PBS的1.5毫升微量离心管中，然后使用杵均质化脾脏。接下来，用一毫升无菌PBS稀释细胞，并通过50微米细胞过滤器将混合物过滤到50毫升锥形管中。使用无菌PBS将过滤的匀浆体积加满至10毫升。
使用血细胞计数器计数10微升稀释匀浆中的细胞。将剩余的细胞在500G下离心五分钟，并除去上清液。然后将细胞重悬于补充的RPMI 1640培养基中，每毫升10至第八个细胞。
使用小鼠NK细胞分离试剂盒磁纯化脾脏NK细胞，并使用流式细胞术确认NK细胞纯度。使用血细胞计数器计数细胞，然后在500G下离心5分钟，然后除去上清液。为了刺激沉淀的NK细胞，将这些细胞重悬于补充的RPMI 1640培养基中的IL-2和IL-15中。
在96孔U底板中每毫升培养10至第六个NK细胞两次48小时。在NK细胞刺激前24小时，用每孔100微升层粘连蛋白涂覆96孔板，并在37摄氏度下孵育45分钟。孵育后，取出溶液，让孔在生物安全柜中风干。
接下来，将安乐死的鼠标固定在板上的俯卧位置。抬起皮肤并沿背柱切开皮肤。切断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分开。
然后通过在颅骨方向切割两侧的肌肉和肋骨来分离脊柱，直到到达颅底。用剪刀剪掉寰枕关节处的脊柱。接下来，从脊柱中去除肌肉和脂肪组织。
在进入通过背根连接到脊髓的椎间孔中的背根神经节或DRG之前，固定并打开椎柱以去除脊髓。接下来，将DRG收获到装有10毫升冰冷补充DMEM的15毫升锥形管中。然后将制剂在室温下以200G离心5分钟，并除去上清液。
加入含有每毫升1毫克胶原酶IV和2.4单位/毫升分散酶II的250微升PBS.将此DRG与胶原酶分散酶溶液一起孵育80分钟，并轻轻搅拌。要灭活酶，加入五毫升补充的DMEM培养基并以200G离心溶液.五分钟后，使用移液管轻轻除去上清液并留下约100微升上清液以避免不必要的细胞损失。接下来，向细胞中加入一毫升补充的DMEM培养基，并使用移液器枪和三个尺寸减小的玻璃巴斯德移液器将DRG轻轻研磨成单细胞制剂。
在生物安全柜中工作时，将牛血清白蛋白或BSA在无菌PBS中稀释至终浓度为15%，并在零下20摄氏度下储存一毫升等分试样。要在15毫升锥形管中创建BSA梯度，请加入两毫升无菌PBS，然后在管底部缓慢分配一毫升15%BSA溶液。通过轻轻取出移液器来避免破坏梯度。
使用P200移液器，将含有神经元的研磨神经节悬浮液添加到试管侧面的梯度中。然后将加速和减速设置为最小值，以200G离心含有BSA梯度的神经元12分钟.离心后，使用移液管除去所有上清液并将细胞重悬于500微升Neurobasal中。板10， 000个神经元每孔在层纤层蛋白包被的平底96孔板中。
为了允许神经元附着，将96孔板在37摄氏度下孵育过夜。要开始共培养，请从神经元培养物中缓慢去除神经基底。用IL-2和IL-15刺激48小时后，重悬NK细胞，并向神经元培养物中每孔向第五个NK细胞添加10个。
在37摄氏度的补充神经基础MX中共培养细胞。48小时后，用PBS收集并洗涤细胞三次，并在4摄氏度下以500G离心5分钟。弃去上清液，然后在4摄氏度下用1至1，000稀释的活性染料eFluor 780染色细胞15分钟。
如图所示洗涤并离心细胞，然后用CD 1632在4摄氏度下处理15分钟以阻断细胞上的非特异性位点，然后用PBS收集和洗涤细胞三次。在下一个洗涤和离心循环后，用BV421，抗NK-1.1，异硫氰酸荧光素抗NKp46和藻红蛋白抗GM-CSF染色细胞15分钟。再次用PBS收集和洗涤细胞三次，离心并丢弃上清液，然后将细胞重悬于500微升FACS缓冲液中，并使用流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析。
当单独培养时，NK细胞表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或GM-CSF和NKp46的基础水平。当与从伤害感受器完整小鼠收获的DRG神经元共培养时，辣椒素刺激降低了GM-CSF的NK细胞表达。当辣椒素与从伤害感受器消融小鼠获得的DRG神经元共培养时，辣椒素对NK细胞活化没有影响。
NKp46的水平不受影响。该协议中的关键步骤是DRG解离和分离。这个想法是通过避免产生气泡和使用合适尺寸的移液器来保持最大的神经元活力。
方案结束后，研究者可以使用RNA测序或qPCR来测量FACS纯化细胞中的转录本变化，或者他们可以使用ELISA来测量细胞因子或神经肽的分泌。这种相互作用表明NK细胞功能可能由伤害感受器神经元调节。这种串扰在从神经损伤、细菌和病毒感染一直到恶性肿瘤的生物过程中可能很重要。
