통각 수용체 뉴런이 다양한 신경 펩티드를 분비하고 NK 세포가 이러한 신경 펩티드에 대한 수용체를 발현한다는 점을 감안할 때, 우리는 NK 세포와 통각 수용체 뉴런 간의 상호 작용을 연구하기위한 공동 배양 방법을 고안하기로 결정했습니다. 이러한 환원주의적 방법은 통각수용체 뉴런이 NK세포의 항종양 기능을 어떻게 조절하는지를 연구하는데 유용할 수 있으며, NK세포가 손상된 뉴런의 제거를 어떻게 조절하는지를 연구하는 것도 흥미로울 수 있다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 전 석사 과정 학생 인 Ali Ahmadi가 될 것입니다.
자연 살해 또는 NK 세포 분리 및 배양을 시작하려면 500 마이크로 리터의 멸균 PBS가 들어있는 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 마우스 비장을 수집 한 다음 유봉을 사용하여 비장을 균질화합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 멸균 PBS로 세포를 희석하고 50 미크론 세포 스트레이너를 통해 혼합물을 50 밀리리터 원추형 튜브로 여과합니다. 여과된 균질액 부피를 멸균 PBS를 사용하여 10 밀리리터로 보충한다.
혈구계를 사용하여 희석된 균질액의 10 마이크로리터에서 세포를 계수한다. 남은 세포를 500 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한다. 이어서 세포를 보충된 RPMI 1640 배지에 밀리리터당 10 내지 8번째 세포로 재현탁시킨다.
마우스 NK 세포 분리 키트를 이용하여 비장 NK 세포를 자기적으로 정제하고 유세포 분석기를 이용하여 NK 세포 순도를 확인하였다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고, 500 G에서 5분에 원심분리한 다음, 상청액을 제거한다. 펠렛화된 NK 세포를 자극하기 위해, 이들 세포를 IL-2 및 IL-15 보충된 RPMI 1640 배양 배지에 재현탁시킨다.
6 밀리리터당 6번째 NK 세포를 96-웰 U-bottom plate에서 2회 배양하여 48시간 동안 배양하였다. NK 세포 자극 24시간 전에 96웰 플레이트를 웰당 100마이크로리터의 라미닌으로 코팅하고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양한다. 배양 후 용액을 제거하고 우물을 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조시킵니다.
다음으로, 안락사 된 마우스를 보드에 엎드린 자세로 고정하십시오. 피부를 들어 올리고 등 지느러미를 따라 피부를 절개하십시오. 요추 관절을 잘라 내고 가위로 요추에서 천골을 분리하십시오.
그런 다음 두개골 바닥에 도달 할 때까지 두개골 방향으로 양쪽의 근육과 갈비뼈를 절단하여 척추를 분리하십시오. 가위를 사용하여 대골 관절의 척추를 자릅니다. 다음으로 척추에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오.
등뿌리를 통해 척수에 연결된 추간공의 등근 신경절 또는 DRG에 접근하기 전에 척추를 고정하고 열어 척수를 제거합니다. 다음으로, DRG를 10 밀리리터의 얼음 감기 보충 DMEM으로 채워진 15 밀리리터 원추형 튜브로 수확합니다. 그 후 상기 제제를 실온에서 200 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
밀리리터 콜라게나제 IV당 1밀리그램과 밀리리터 디스파아제 II당 2.4단위를 포함하는 250마이크로리터의 PBS를 추가합니다.이 DRG를 콜라게나제-디스파제 용액과 함께 80분 동안 온화한 교반으로 배양합니다. 효소를 비활성화하려면 보충 된 DMEM 배지 5 밀리리터를 추가하고 200G에서 용액을 원심 분리합니다.5 분 후 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 제거하고 원치 않는 세포 손실을 피하기 위해 약 100 마이크로 리터의 상청액을 남겨 둡니다. 다음으로, 1밀리리터 보충 DMEM 배지를 세포에 추가하고 피펫 건과 크기가 감소하는 3개의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 DRG를 단일 세포 제제로 부드럽게 분쇄합니다.
생물안전 캐비닛에서 작업하는 동안 소 혈청 알부민 또는 BSA를 멸균 PBS에서 최종 농도 15%로 희석하고 섭씨 영하 20도에서 1밀리리터 분취량을 저장합니다. 15밀리리터 원추형 튜브에 BSA 그래디언트를 생성하려면 멸균 PBS 2밀리리터를 추가한 다음 튜브 바닥에 15% BSA 용액 1밀리리터를 천천히 분배합니다. 피펫을 부드럽게 제거하여 그라디언트를 방해하지 마십시오.
P200 피펫을 사용하여 뉴런이 포함된 분쇄된 신경절 현탁액을 튜브 측면에 그래디언트에 추가합니다. 그런 다음 가속 및 감속을 최소로 설정하여 BSA 구배가 포함된 뉴런을 200G에서 12분 동안 원심분리합니다.원심분리한 후 피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거하고 세포를 500마이크로리터의 Neurobasal에 재현탁시킵니다. 플레이트는 웰당 10, 000개의 뉴런을 라미닌 코팅된 편평한 바닥 96-웰 플레이트에 포함한다.
뉴런의 부착을 허용하려면 섭씨 37도에서 밤새 96웰 플레이트를 배양합니다. 공동 배양을 시작하려면 뉴런 배양에서 신경 기저를 천천히 제거하십시오. IL-2 및 IL-15로 48시간 자극한 후, NK 세포를 재현탁시키고 웰당 5번째 NK 세포를 뉴런 배양에 첨가한다.
섭씨 37도에서 보충 된 신경 기저 MX에서 세포를 공동 배양합니다. 48시간 후, 세포를 수집하여 PBS로 3회 세척하고, 섭씨 4도에서 500G에서 5분간 원심분리한다. 세포를 1 내지 1, 000으로 희석된 생존율 염료 eFluor 780으로 염색하기 전에 상층액을 섭씨 4도에서 15분 동안 폐기한다.
입증된 바와 같이 세포를 세척 및 원심분리하고, 이어서 섭씨 4도에서 15분 동안 CD 1632로 처리하여 세포 상의 비특이적 부위를 차단하고, 이어서 세포를 수집하고 PBS로 3회 세척하였다. 세척 및 원심 분리의 다음 사이클 후, 세포를 BV421, 항 -NK-1.1, 플루오 레신 이소 티오 시아 네이트 항 -NKp46 및 피코 에리트린 항 -GM-CSF로 15 분 동안 염색한다. 다시 한번, 세포를 채취하여 PBS로 3회 세척하고, 이를 원심분리하여 상층액을 버린 다음, 유세포 분석기를 이용하여 NK 세포를 500 마이크로리터의 FACS 완충액과 면역표현형에 재현탁시킨다.
NK 세포는 단독으로 배양하였을 때, 기저 수준의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 또는 GM-CSF 및 NKp46을 발현하였다. 통각 수용체 무손상 마우스에서 수확한 DRG 뉴런과 공동 배양했을 때, 캡사이신 자극은 NK 세포 GM-CSF의 발현을 감소시켰다. 캡사이신은 통각 수용체 절제 마우스에서 수확 한 DRG 뉴런과 공동 배양했을 때 NK 세포 활성화에 영향을 미치지 않았습니다.
NKp46의 수준은 영향을받지 않았습니다. 이 프로토콜의 핵심 단계는 DRG 분리 및 격리입니다. 아이디어는 거품을 피하고 올바른 크기의 피펫을 사용하여 최대 신경 생존력을 유지하는 것입니다.
프로토콜 후 연구자는 RNA 시퀀싱 또는 qPCR을 사용하여 FACS 정제 세포의 전사체 변화를 측정하거나 ELISA를 사용하여 사이토카인 또는 뉴로펩타이드의 분비를 측정할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 NK 세포 기능이 통각 수용체 뉴런에 의해 조정되었을 가능성이 있음을 보여줍니다. 그리고이 누화는 신경 손상, 박테리아 및 바이러스 감염에서 악성 종양에 이르는 생물학적 과정에서 중요 할 수 있습니다.
