Dato che i neuroni nocicettori secernono vari neuropeptidi e che le cellule NK esprimono il recettore per questi neuropeptidi, abbiamo deciso di ideare un metodo di co-coltura per studiare l'interazione tra la cellula NK e i neuroni nocicettori. Tale metodo riduzionista potrebbe essere utile per studiare come i neuroni nocicettori controllano la funzione antitumorale delle cellule NK, e potrebbe anche essere interessante studiare come le cellule NK controllano l'eliminazione dei neuroni feriti. A dimostrare la procedura sarà Ali Ahmadi, un ex studente di master del mio laboratorio.
Per iniziare l'isolamento e la coltura del natural killer o delle cellule NK, raccogliere la milza del topo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di PBS sterile, quindi omogeneizzare la milza usando un pestello. Quindi, diluire le cellule con un millilitro di PBS sterile e filtrare la miscela attraverso un filtro cellulare da 50 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Riempire il volume omogenato filtrato a 10 millilitri utilizzando PBS sterile.
Contare le cellule in 10 microlitri di omogenato diluito usando un emocitometro. Centrifugare le cellule rimanenti per cinque minuti a 500 G e rimuovere il surnatante. Quindi risospendere le celle da 10 all'ottava cella per millilitro nel mezzo RPMI 1640 integrato.
Purificare magneticamente le cellule NK della milza utilizzando un kit di isolamento delle cellule NK del topo e confermare la purezza delle cellule NK utilizzando la citometria a flusso. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, seguito da centrifugazione a cinque minuti a 500 G, quindi rimuovere il surnatante. Per stimolare le cellule NK pellettizzate, risospendere queste cellule in terreno di coltura RPMI 1640 integrato con IL-2 e IL-15.
Coltura due volte 10 alla sesta cellula NK per millilitro in una piastra inferiore a U a 96 pozzetti per 48 ore. 24 ore prima della stimolazione delle cellule NK, rivestire la piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri per pozzetto di laminina e incubarla per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e lasciare asciugare i pozzetti all'aria nell'armadio di biosicurezza.
Quindi, fissare il mouse eutanasia sulla lavagna in posizione prona. Sollevare la pelle e incidere la pelle lungo la colonna dorsale. Tagliare l'articolazione lombosacrale e separare l'osso sacro dalla colonna lombare con le forbici.
Quindi separare la colonna vertebrale tagliando i muscoli e le costole su entrambi i lati nella direzione cranica fino a raggiungere la base del cranio. Usa le forbici per tagliare la colonna vertebrale all'articolazione atlantooccipitale. Quindi, rimuovere il muscolo e il tessuto adiposo dalla colonna vertebrale.
Pin e aprire la colonna vertebrale per rimuovere il midollo spinale prima di accedere al ganglio della radice dorsale o DRG nei forami intervertebrali collegati al midollo spinale attraverso la radice dorsale. Quindi, raccogliere i DRG in un tubo conico da 15 millilitri riempito con 10 millilitri di DMEM integrato ghiacciato. Quindi centrifugare il preparato per cinque minuti a 200 G a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
Aggiungere un 250 microlitri di PBS contenente un milligrammo per millilitro di collagenasi IV e 2,4 unità per millilitro di dispasi II.Incubare questo DRG con soluzione di collagenasi-dispasi per 80 minuti con lieve agitazione. Per inattivare gli enzimi, aggiungere cinque millilitri di mezzo DMEM integrato e centrifugare la soluzione a 200 G.Dopo cinque minuti, rimuovere delicatamente il surnatante usando una pipetta e lasciare circa 100 microlitri di surnatante per evitare perdite cellulari indesiderate. Quindi, aggiungere un mezzo DMEM integrato in millilitro alle celle e utilizzare una pistola per pipette e tre pipette Pasteur in vetro di dimensioni decrescenti per triturare delicatamente il DRG in una preparazione a cella singola.
Mentre si lavora in un armadio di biosicurezza, diluire l'albumina sierica bovina o BSA in PBS sterile a una concentrazione finale del 15% e conservare aliquote di un millilitro a meno 20 gradi Celsius. Per creare un gradiente BSA in un tubo conico da 15 millilitri, aggiungere due millilitri di PBS sterile e quindi erogare lentamente un millilitro di soluzione BSA al 15% sul fondo del tubo. Evitare di interrompere la sfumatura rimuovendo delicatamente la pipetta.
Utilizzando una pipetta P200, aggiungere la sospensione di gangli triturati contenente i neuroni sul lato del tubo nel gradiente. Quindi impostare l'accelerazione e la decelerazione al minimo per centrifugare il neurone contenente il gradiente BSA per 12 minuti a 200 G.Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante usando una pipetta e risospendere le cellule in 500 microlitri di Neurobasale. Piastra 10.000 neuroni per pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti rivestita di aminina.
Per consentire l'attaccamento dei neuroni, incubare la piastra a 96 pozzetti durante la notte a 37 gradi Celsius. Per iniziare la co-coltura, rimuovere lentamente il neurobasale dalla coltura neuronale. Dopo 48 ore di stimolazione con IL-2 e IL-15, risospendere le cellule NK e aggiungere 10 alla quinta cellula NK per pozzetto alla coltura neuronale.
Co-coltura delle cellule in MX neurobasale integrato a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, raccogliere e lavare le cellule tre volte con PBS e centrifugarle per cinque minuti a 500 G a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante prima di colorare le cellule con uno a 1.000 colorante vitalità diluito eFluor 780 per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Lavare e centrifugare le cellule come dimostrato, quindi trattare con CD 1632 per 15 minuti a quattro gradi Celsius per bloccare siti non specifici sulle cellule, seguito dalla raccolta e dal lavaggio delle cellule con PBS tre volte. Dopo il successivo ciclo di lavaggio e centrifugazione, colorare le cellule con BV421, anti-NK-1.1, fluoresceina isotiocianato anti-NKp46 e ficoeritrina anti-GM-CSF per 15 minuti. Ancora una volta, raccogliere e lavare le cellule tre volte con PBS, centrifugarle e scartare il surnatante, quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone FACS e immunofenotipo le cellule NK utilizzando la citometria a flusso.
Quando coltivate da sole, le cellule NK hanno espresso livelli basali di fattore stimolante le colonie di macrofagi granulocitari o GM-CSF e NKp46. Quando co-coltivato con neuroni DRG raccolti da topi nocicettori intatti, la stimolazione della capsaicina ha diminuito l'espressione delle cellule NK del GM-CSF. La capsaicina non ha avuto alcun impatto sulle attivazioni delle cellule NK quando co-coltivata con neuroni DRG raccolti da topi ablati con nocicettori.
Il livello di NKp46 non è stato influenzato. I passaggi chiave di questo protocollo sono la dissociazione e l'isolamento DRG. L'idea è quella di mantenere la massima vitalità neuronale evitando di fare bolle e usando la giusta pipetta.
Dopo il protocollo, lo sperimentatore può utilizzare il sequenziamento dell'RNA o la qPCR per misurare il cambiamento della trascrizione nelle cellule purificate FACS, oppure può utilizzare ELISA per misurare la secrezione di citochine o neuropeptidi. Tale interazione rivela che la funzione delle cellule NK è probabilmente sintonizzata dal neurone nocicettore. E questa diafonia può essere importante nei processi biologici che vanno dalle lesioni nervose, alle infezioni batteriche e virali, fino ai tumori maligni.
